基因改造骨髓造血干細胞靶向抑制結直腸癌新生血管形成的實驗研究.pdf

1、第一部分：
　　目的：構建含有Tie2基因啟動子增強子以及同時含有內皮抑素基因的重組慢病毒質粒并轉染小鼠骨髓造血干細胞。
　　方法：從小鼠的肝臟中提取小鼠Tie2基因啟動子與增強子，進行鑒定，將之克隆到轉移質粒載體pGL-3basic中，然后轉入慢病毒質粒TG005。繼續(xù)將獲贈的內皮抑素ES基因轉入改裝過的轉移質粒載體pGL-3basic-Tie2p/e，構建pGL-3basic-Tie2p/e-ES。同樣轉化入慢病毒質粒T

2、G005。都通過293T細胞進行細胞內重組后獲得TG005-Tie2p/e和TG005-Tie2p/e-ES。采用PCR的方法對完成重組的慢病毒質粒進行鑒定。從小鼠骨髓中提取造血干細胞，進行篩選，將獲取的Lin一骨髓造血干細胞用構建的慢病毒進行轉染，篩選轉染成功的細胞并鑒定細胞內的ES產(chǎn)物。
　　結果：從小鼠的肝臟成功獲得了Tie2基因的啟動子和增強子，克隆入慢病毒質粒載體后，也成功的酶切鑒定。獲贈的ES基因也成功克隆并轉入了慢病

3、毒質粒后酶切鑒定。PCR方法證實該慢病毒質粒改造完成。提取了骨髓造血干細胞后進行了篩選，篩選后轉染了相應的病毒并表達了ES。
　　結論：慢病毒質粒載體是一種高效、簡便、快捷的病毒載體，能有效的感染細胞，轉入并表達相應的目的基因。
　　第二部分：
　　目的：評估攜帶了Tie2基因啟動子和增強子以及內皮抑素基因的骨髓造血干細胞在抑制結直腸癌動物模型血管新生和腫瘤增殖中的作用。
　　方法：Lovo結直腸癌細胞株建立裸鼠

4、結直腸癌模型后，40只裸鼠分為NS、HSC、慢病毒、Tie2和ES共5組，每組8只。每組分別在尾靜脈給予相應的治療。治療期間定期測量腫瘤的體積。治療結束后，取腫瘤組織進行體積重量測定，Ⅷ因子和Tunel染色評價腫瘤內血管和凋亡細胞的多少。電鏡觀察血管形態(tài)并觀察其他臟器的血管形成情況。
　　結果：各個實驗組之間在治療開始時，腫瘤體積無明顯差異(p=0.5)。在治療終止期，Tie2組的腫瘤比ES組明顯增大(P<0.01)。微血管計數(shù)的