胰腺癌細(xì)胞中MeCP2通過(guò)結(jié)合LIN28基因的甲基化CpG島而調(diào)控其表達(dá).pdf

1、研究目的:
　　1.研究LIN28基因在三種人胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況及各細(xì)胞增殖和遷移能力的差異;
　　2.研究三種人胰腺癌細(xì)胞株中LIN28基因CpG島的DNA甲基化狀態(tài);
　　3.探索甲基化結(jié)合蛋白在三種人胰腺癌細(xì)胞株中的LIN28基因CpG島DNA甲基化中的作用;
　　4.探索LIN28基因的表達(dá)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株增殖及遷移能力的影響;
　　研究方法:
　　1.檢測(cè)LIN28基因在三種人胰腺癌細(xì)

2、胞株中的表達(dá)情況及各細(xì)胞株的增殖和遷移率
　　1.1在三株人胰腺癌細(xì)胞中檢測(cè)LIN28的表達(dá)
　　培養(yǎng)低分化的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、中分化的細(xì)胞SW1990和PaTu8988，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，定量PCR法檢測(cè)LIN28基因的mRNA表達(dá)水平;提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，Western Blot法檢測(cè)LIN28基因的蛋白表達(dá)水平。
　　1.2檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株的增殖能力
　　培養(yǎng)低分化的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、中分化的細(xì)

3、胞SW1990和PaTu8988，采用CCK8法檢測(cè)上述胰腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖速率。
　　1.3檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株的遷移能力
　　培養(yǎng)低分化的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、中分化的細(xì)胞SW1990和PaTu8988，采用Transwell小室法檢測(cè)上述胰腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞遷移速率。
　　2.檢測(cè)三種胰腺癌細(xì)胞株中LIN28基因CpG島的甲基化狀態(tài)
　　2.1亞硫酸鹽修飾后測(cè)序法檢測(cè)LIN28基因CpG島的甲基化狀態(tài)

4、　　培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988，提取基因組DNA，采用亞硫酸鹽修飾后測(cè)序法檢測(cè)上述細(xì)胞中LIN28基因CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　2.2檢測(cè)甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR處理對(duì)胰腺癌細(xì)胞株中LIN28基因表達(dá)的影響
　　培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988，5-Aza-CdR處理72h，提取總RNA，定量PCR法檢測(cè)LIN28基因mRNA水平表達(dá)的變化;提取總蛋白，We

5、stern Blot法檢測(cè)LIN28基因蛋白水平表達(dá)的變化。
　　3.初步探索甲基化結(jié)合蛋白在胰腺癌細(xì)胞中LIN28基因CpG島甲基化中的作用
　　3.1檢測(cè)甲基化結(jié)合蛋白在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988，Western Blot法檢測(cè)各細(xì)胞中MeCP2、MBD2、MBD3蛋白的表達(dá)。
　　3.2檢測(cè)甲基化結(jié)合蛋白對(duì)LIN28基因CpG島的轉(zhuǎn)錄抑制
　

6、　采用染色質(zhì)共沉淀法檢測(cè)MeCP2和MBD3與LIN28基因CpG島的結(jié)合能力。將干擾質(zhì)粒pLKO.1-puro-shMeCP2和pLKO.1-puro-shMBD3分別轉(zhuǎn)染至PANC1和PaTu8988細(xì)胞中，鑒定質(zhì)粒的干擾效果后分別運(yùn)用定量PCR法和Western Blot法檢測(cè)LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　4.探索LIN28基因的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響
　　4.1鑒定LIN28基

7、因的干擾效果
　　將LIN28干擾質(zhì)粒shLIN28及其對(duì)照質(zhì)粒sheGFP分別轉(zhuǎn)染入PANC1細(xì)胞中，分別采用定量PCR法和Western Blot法檢測(cè)LIN28基因的干擾效果。
　　4.2檢測(cè)下調(diào)LIN28基因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖和遷移能力的影響
　　將LIN28干擾質(zhì)粒shLIN28及其對(duì)照質(zhì)粒sheGFP分別轉(zhuǎn)染入PANC1細(xì)胞中，分別采用CCK8法和Transwell小室法檢測(cè)其增殖率和遷移率的變化。
　

8、　4.3鑒定LIN28基因的過(guò)表達(dá)效果
　　將LIN28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒3×Flag-LIN28及其對(duì)照質(zhì)粒3×Flag-vector分別轉(zhuǎn)染入PaTu8988和SW1990細(xì)胞中，分別采用定量PCR法和Western Blot法檢測(cè)LIN28的過(guò)表達(dá)效果。
　　4.4檢測(cè)過(guò)表達(dá)LIN28對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響
　　將LIN28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒3×Flag-LIN28及其對(duì)照質(zhì)粒3×Flag-vector分別轉(zhuǎn)染入PaT

9、u8988和SW1990細(xì)胞中，分別采用CCK8法和Transwell法檢測(cè)其增殖率和遷移率的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.胰腺癌細(xì)胞株中LIN28基因的表達(dá)與其增殖和遷移率有關(guān)
　　1.1在胰腺癌細(xì)胞株中檢測(cè)LIN28的表達(dá)，SW1990和PaTu8988細(xì)胞中LIN28的表達(dá)量顯著低于PANC1細(xì)胞
　　在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中檢測(cè)LIN28的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PANC1細(xì)胞中LI

10、N28基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量都明顯高于SW1990和PaTu8988細(xì)胞，并且SW1990和PaTu8988細(xì)胞中LIN28的表達(dá)量極低。
　　1.2在胰腺癌細(xì)胞株中檢測(cè)各細(xì)胞的增殖和遷移率，PANC1細(xì)胞明顯高于SW1990和PaTu8988細(xì)胞
　　比較胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988的增殖和遷移率，發(fā)現(xiàn)PANC1細(xì)胞的增殖和遷移率均顯著高于SW1990和PaTu8988細(xì)胞。因此，推

11、測(cè)LIN28的表達(dá)量可能與胰腺癌細(xì)胞的惡性程度有關(guān)。
　　2.胰腺癌細(xì)胞株中LIN28基因CpG島的高甲基化抑制其轉(zhuǎn)錄
　　2.1胰腺癌細(xì)胞株中LIN28基因CpG島呈高甲基化狀態(tài)
　　對(duì)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中的LIN28基因的兩段連續(xù)的CpG島分別進(jìn)行亞硫酸鹽修飾后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，上述細(xì)胞中LIN28基因的兩段CpG島均呈高甲基化狀態(tài)。PANC1、SW1990和PaTu8988細(xì)胞中第一段

12、CpG島的甲基化效率分別為67.69％±2.5％，86.15％±3.5％和98.46％±4％;而相應(yīng)細(xì)胞第二段CpG島的甲基化效率分別為74.60％±3％，83.33％±1.5％和92.85％±2.5％。
　　2.2胰腺癌細(xì)胞株中的LIN28基因在甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR處理下轉(zhuǎn)錄激活
　　在5-Aza-CdR作用下，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中的LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表

13、達(dá)量均顯著提高。
　　3.甲基化結(jié)合蛋白MeCP2調(diào)控LIN28基因的轉(zhuǎn)錄
　　3.1 MeCP2在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量較高
　　在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中檢測(cè)甲基化結(jié)合蛋白MeCP2、MBD2和MBD3的表達(dá)，其中MeCP2和MBD3在上述各細(xì)胞株中的表達(dá)較高，而MBD2的表達(dá)量很低。而MBD3在DNA甲基化中無(wú)抑制作用，因此推測(cè)，MeCP2可能在LIN28基因的轉(zhuǎn)錄抑制過(guò)程中發(fā)揮重要

14、的功能。
　　3.2 MeCP2特異性地結(jié)合甲基化的LIN28基因CpG島
　　以LIN28基因第二段CpG島為模板，結(jié)合染色質(zhì)共沉淀法與普通PCR或定量PCR法，發(fā)現(xiàn)MeCP2能特異性地結(jié)合到甲基化的LIN28基因CpG島。在PANC1和PaTu8988細(xì)胞中下調(diào)MeCP2后，LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量均有所提高，驗(yàn)證了MeCP2對(duì)LIN28基因的轉(zhuǎn)錄抑制。
　　4.LIN28基因的表達(dá)量與胰腺癌

15、細(xì)胞的增殖和遷移能力有關(guān)
　　4.1 LIN28干擾質(zhì)粒能顯著下調(diào)PANC1細(xì)胞中LIN28的表達(dá)
　　在PANC1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LIN28干擾質(zhì)粒后，LIN28在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量較對(duì)照組均明顯下降。
　　4.2下調(diào)LIN28明顯抑制PANC1細(xì)胞的增殖和遷移能力
　　下調(diào)LIN28的表達(dá)后，PANC1細(xì)胞的增殖率和遷移率均顯著下降。
　　4.3 LIN28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒能顯著上調(diào)SW1990和PaTu8

16、988細(xì)胞中LIN28的表達(dá)
　　在SW1990和PaTu8988細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LIN28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，LIN28在mRNA水平的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高。實(shí)驗(yàn)組Flag-LIN28融合蛋白檢測(cè)陽(yáng)性，而對(duì)照組陰性，提示LIN28過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入SW1990和PaTu8988細(xì)胞中。
　　4.4上調(diào)LIN28顯著增強(qiáng)SW1990和PaTu8988細(xì)胞的增殖和遷移能力
　　上調(diào)LIN28的表達(dá)后，SW1990和PaTu898

17、8細(xì)胞的增殖率和遷移率均顯著增高。
　　研究結(jié)論:
　　1.LIN28表達(dá)于低分化的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1中，而在中分化的SW1990和PaTu8988細(xì)胞中的表達(dá)量極低。
　　2.胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中LIN28基因CpG島的高甲基化導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄抑制，而PANC1細(xì)胞的甲基化效率明顯低于SW1990和PaTu8988細(xì)胞。
　　3.甲基化結(jié)合蛋白MeCP2調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中LIN2