SOCS3甲基化協(xié)同Reg3A過表達(dá)參與胰腺癌發(fā)病的機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究胰腺癌細(xì)胞中SOCS3和Reg3A表達(dá)差異以及SOCS3甲基化情況，明確SOCS3甲基化和Reg3A過表達(dá)與胰腺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)性；進(jìn)一步探討SOCS3對Reg3A介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，以及炎癥環(huán)境下二者對細(xì)胞增殖的影響，以確定二者在胰腺炎癥惡性轉(zhuǎn)化以及胰腺癌發(fā)病過程中的作用，為研究胰腺癌發(fā)病機(jī)制和尋找胰腺癌藥物治療靶點(diǎn)提供新思路。
　　方法：首先，以人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6C7和AsPC-1、BxPC-3、Mia

2、 Paca-2、PANC-1、SW1990五種胰腺癌細(xì)胞株為研究對象，分析細(xì)胞中Reg3A，SOCS3和DNMT1的表達(dá)，MSP檢測細(xì)胞SOCS3甲基化情況。采用1μM DAC連續(xù)作用SW1990細(xì)胞4d，誘導(dǎo)去甲基化，檢測去甲基化后細(xì)胞SOCS3及DNMT1蛋白表達(dá)情況；同時MTT法和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖；FACS檢測細(xì)胞周期和凋亡；Real-time PCR檢測SOCS3、cyclin D1、Bcl-2表達(dá)。其次，采用50

3、ng/mL外源性Reg3A作用胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖的影響；siRNA干擾HPDE6C7細(xì)胞SOCS3表達(dá)，BxPC-3和SW1990胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染SOCS3野生型質(zhì)粒后，分別觀察Reg3A對細(xì)胞增殖的影響。MTT法檢測細(xì)胞活力及克隆形成，F(xiàn)ACS測定細(xì)胞周期，IF分析cyclin D1表達(dá)。Western Blot和Real-time PCR檢測STAT3及NF-κB的表達(dá)。再次，分別采用不同濃度IL-6、TN

4、F-α、IL-1β作用HPDE6C7細(xì)胞24h后，Western Blot檢測內(nèi)源性Reg3A表達(dá)，尋找Reg3A上游分子。在IL-6炎癥環(huán)境下，觀察外源性Reg3A對人胰導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖的影響，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，F(xiàn)ACS測定細(xì)胞周期，Real-time PCR和IF分析cyclin D1的表達(dá)。最后，在IL-6炎癥背景下，采用siRNA沉默細(xì)胞SOCS3，外源性Reg3A干預(yù)細(xì)胞后，檢測增殖相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果：首先，S

5、W1990，AsPC-1，Mia Paca-2三株胰腺癌細(xì)胞SOCS3基因 CpG島存在甲基化。1μM DAC干預(yù)可逆轉(zhuǎn)SW1990細(xì)胞SOCS3甲基化狀態(tài)，恢復(fù)SOCS3蛋白表達(dá)。DAC通過抑制細(xì)胞活性，降低克隆形成率，阻滯細(xì)胞周期G2/M期和下調(diào)cyclin D1的表達(dá)發(fā)揮抑制SW1990細(xì)胞增殖的作用；DAC通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其次，外源性Reg3A可顯著促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞增殖，cyclinD1轉(zhuǎn)錄

6、水平表達(dá)，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量減少，S期細(xì)胞數(shù)量增加。人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞SOCS3沉默后，Reg3A介導(dǎo)的促增殖作用增強(qiáng)；胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染SOCS3質(zhì)粒，抑制外源性Reg3A的促增殖作用。外源性Reg3A可誘導(dǎo)細(xì)胞NF-κB和STAT3表達(dá)，SOCS3敲除后HPDE6C7細(xì)胞NF-κB和STAT3顯著上調(diào)，胰腺癌細(xì)胞SOCS3過表達(dá)二者表達(dá)降低。最后，IL-6和TNF-α可上調(diào)HPDE6C7細(xì)胞內(nèi)源性Reg3A的表達(dá)。IL-6炎癥環(huán)境中R

7、eg3A能增加細(xì)胞活力，細(xì)胞G0/G1期數(shù)量下降，S期數(shù)量顯著增加，cyclin D1表達(dá)顯著上調(diào)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染SOCS3 siRNA后經(jīng)IL-6和Reg3A共同作用，細(xì)胞增殖作用顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論：人胰腺癌細(xì)胞株SOCS3表達(dá)下調(diào)與其基因CpG島高甲基化有關(guān)。去甲基化劑DAC可逆轉(zhuǎn)SW1990細(xì)胞SOCS3甲基化，上調(diào)SOCS3表達(dá)，并能顯著抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SOCS3基因甲基化可能在胰腺癌發(fā)生及發(fā)展有相關(guān)性。人胰腺癌細(xì)