腺相關(guān)病毒(AAV)過表達(dá)Follistatin在綿羊成肌細(xì)胞中的研究.pdf

1、近年來，病毒介導(dǎo)方法被逐漸應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)。病毒載體，包括如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒和慢病毒等提供了一種可替代性和高效的傳遞機(jī)制。腺相關(guān)病毒(AAV)結(jié)構(gòu)簡單，無致病性，且可以細(xì)小病毒位點特異的方式整合到染色體中。腺相關(guān)病毒載體可轉(zhuǎn)染各種組織細(xì)胞，包括骨骼肌，并且已被證實在小鼠中沒有引起免疫應(yīng)答。這些特性使AAV系統(tǒng)在病毒來源的基因傳遞和表達(dá)載體中具有很高的生物安全性。卵泡抑制素(FST)已被證實是包括肌肉生長抑制素(MSTN基因)在

2、內(nèi)的TGB—β家族相關(guān)成員的一種有效拮抗劑。MSTN負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞的分化和增殖。最近的一些研究強(qiáng)調(diào)了MSTN基因抑制的潛在應(yīng)用，如在牛上MSTN基因缺失以及小鼠中MSTN基因敲除顯示的雙肌表型。綿羊作為一種重要的經(jīng)濟(jì)動物，雙肌綿羊育種具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。然而，在綿羊上僅有一些關(guān)于慢病毒載體介導(dǎo)FST基因的研究，通過AAV表達(dá)FST基因還見報道。使用AAV載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物可以增加生物研究安全等級。本研究的目的是構(gòu)建攜帶FST基因的重組A

3、AV血清型2(rAAV2)載體，探討FST對綿羊原代成肌細(xì)胞的體外增殖和分化作用。在本研究中，我們對AAV-2病毒載體攜帶FST基因可以在體外誘導(dǎo)綿羊成肌細(xì)胞分化和增殖的假說進(jìn)行了驗證。主要研究結(jié)果如下:
　　1.烏珠穆沁羊原代成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)。原代成肌細(xì)胞采自50-60日齡的綿羊胎兒。培養(yǎng)的細(xì)胞具有成肌細(xì)胞典型的梭形狀形態(tài)，生長良好，可用于質(zhì)粒和腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的后續(xù)實驗。
　　2.克隆獲得Follistatin基因的全

4、長序列，含有一個1035bp，編碼344個氨基酸，并進(jìn)行了測序（GenBank，登錄號KF833357）。依據(jù)FST的CDS序列，利用NCBI的軟件推導(dǎo)其氨基酸序列，并進(jìn)行氨基酸序列的多重比對。
　　3.在成功克隆綿羊Follistatin基因后，將其連接到真核表達(dá)載體pAAV-IRES-GFP質(zhì)粒中，構(gòu)建綿羊FST過表達(dá)載體pAAV-CFS-FLAG。
　　4.將重組pAAV-CFS-FLAG載體與兩個輔助質(zhì)粒(pAAV-

5、RC和pHelper)共轉(zhuǎn)293細(xì)胞，獲得AAV病毒顆粒。AAV病毒顆粒以感染復(fù)數(shù)(MOI)為50，對綿羊原代成肌細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，Western blot結(jié)果證實AAV2可以在原代成肌細(xì)胞中表達(dá)FST蛋白。
　　5.相比對照組，光密度(450 nm)在轉(zhuǎn)染的原代成肌細(xì)胞中顯著增加，這表明FST有顯著的增殖。定量PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)ST基因過表達(dá)使得AktⅠ和CDK2的表達(dá)顯著增加，而p21的表達(dá)降低。另一方面，細(xì)胞周期分析表明，F(xiàn)S

6、T下調(diào)CDK抑制劑p21，并提高CDK2在OPM細(xì)胞中的表達(dá)水平。FST正調(diào)節(jié)細(xì)胞的G1到S期，過表達(dá)follistatin基因通過下調(diào)p21基因的轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞增殖。
　　6.為了進(jìn)一步開展FST靶基因的功能及鑒定，我們分析了綿羊成肌細(xì)胞中ERK1/2信號通路是否也調(diào)節(jié)FST的表達(dá)。結(jié)果表明FST過表達(dá)充分誘導(dǎo)ERK在細(xì)胞中激活。AAV2介導(dǎo)的FST過表達(dá)分別導(dǎo)致ERK1和pERK2表達(dá)量增加1.7倍和2.3倍(P＜0.

7、01)。正如我們的預(yù)期，ERK（主要是P42 MAPK）在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中被充分激活。這些結(jié)果表明，通過ERK通路的激活使FST過表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。
　　7.對Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究結(jié)果表明，F(xiàn)ST對ERK1/2和PI3K/Akt通路有調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)ST誘導(dǎo)了ERK1/2和Akt的磷酸化，從而促進(jìn)綿羊成肌細(xì)胞的增殖。
　　8.通過吉姆薩染色來確定形成肌小管的細(xì)胞核數(shù)量，通過形成肌管的細(xì)胞核的比例來評價融合效率。在肌管轉(zhuǎn)染AAV

8、-CFS-FLAG的融合率為47.11％，顯著高于在非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中觀察到的32.05％，結(jié)果表明，在分化培養(yǎng)基中添加FST有助于更多的肌管形成。定量PCR結(jié)果也顯示，在分化條件下，F(xiàn)ST過表達(dá)可以促進(jìn)肌細(xì)胞生成素、肌醇D、Myf5、p57和p21 mRNA的表達(dá)，但對MSTN和ActRIIB mRNA的表達(dá)沒有影響。這些研究結(jié)果表明，F(xiàn)ST在增殖條件下通過上調(diào)標(biāo)記基因誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。
　　9.本研究中，我們用流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)基因

9、細(xì)胞進(jìn)行分類排序。經(jīng)過第一次（3代）和第二次（6代）的分選，細(xì)胞陽性率分別達(dá)到92.5％和99％。陽性細(xì)胞的生長狀況良好，Southern雜交結(jié)果表明，AAV載體以隨機(jī)整合的方式插入到基因組位點中，并在FST過表達(dá)下促進(jìn)轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞的增殖和分化。
　　10.FST過表達(dá)對處于G1期的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞有干擾作用。我們對細(xì)胞進(jìn)行碘化丙啶染色后，用熒光激活細(xì)胞分類器(FACS)分析細(xì)胞周期。染色結(jié)果揭示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在G0/G1細(xì)胞分裂期降低了