熱休克蛋白作為多發(fā)性骨髓瘤免疫治療靶向的研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤，在美國2010年全年新發(fā)病人數(shù)大概在20000人。骨髓瘤占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤13.4％，占所有因血液系統(tǒng)惡性腫瘤死亡的19％及所有腫瘤死亡的2％。美國2010年有10,000名左右患者因骨髓瘤死亡。骨髓瘤患者的總體預(yù)后是不好的。接受常規(guī)治療的患者中位生存為3-4年，而接受自體外周血造血干細(xì)胞移植患者中位生存被延長到5-7年，一些新藥也已經(jīng)與其他傳統(tǒng)療法聯(lián)合應(yīng)用于臨床并可能進(jìn)一步改善預(yù)后。但就目

2、前結(jié)果提示，幾乎所有患者最終都會復(fù)發(fā)。異基因造血干細(xì)胞移植是目前唯一一種能有希望治愈多發(fā)性骨髓瘤的治療手段，但是選擇異基因造血干細(xì)胞移植治療的時(shí)機(jī)及這種治療起到的作用尚存在爭論。多發(fā)性骨髓瘤患者化療/移植后復(fù)發(fā)的根源是機(jī)體內(nèi)殘存的微小殘留病灶，我們迫切的需要一種治療方式，它能夠在患者完成造血干細(xì)胞移植后清除微小殘留病灶。免疫治療可以成為控制或消除微小殘留病灶的一個(gè)選擇，我們期待它能夠鞏固接受化療或干細(xì)胞移植治療患者的療效。
　　

3、 骨髓瘤細(xì)胞分泌的單克隆免疫球蛋白都帶有獨(dú)特的抗原決定簇，這可能成為一個(gè)腫瘤特異性抗原。有學(xué)者將患者血漿中的獨(dú)特型免疫球蛋白提取并接種在患者體內(nèi)進(jìn)行免疫治療，但是結(jié)果不盡如人意。部分原因是因?yàn)檫@種獨(dú)特型免疫球蛋白免疫原性較弱，而且每位患者體內(nèi)的這種獨(dú)特型抗原都是獨(dú)一無二的，其他患者無法從針對該獨(dú)特型免疫球蛋白的疫苗或其介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)抗骨髓瘤效應(yīng)中受益。因此我們迫切的需要一種新的腫瘤相關(guān)抗原作為骨髓瘤免疫治療靶點(diǎn)，這個(gè)靶點(diǎn)

4、應(yīng)當(dāng)是大部分骨髓瘤細(xì)胞共有的一種抗原，并且可以在大部分患者中誘導(dǎo)出足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
　　 熱休克蛋白就是具有這些特點(diǎn)的一類腫瘤相關(guān)抗原，它包括熱休克蛋白27、熱休克蛋白70及熱休克蛋白90,在很多腫瘤中優(yōu)先的高表達(dá)，并且在某些腫瘤中的高表達(dá)常提示患者預(yù)后極差并對治療藥物耐受。同時(shí)熱休克蛋白對于腫瘤細(xì)胞的生存至關(guān)重要，下調(diào)或者抑制熱休克蛋白的表達(dá)會使骨髓瘤細(xì)胞顯著凋亡。一種熱休克蛋白90的抑制劑已經(jīng)完成了Ⅰ期臨床試驗(yàn)。
　

5、　 熱休克蛋白的這些特性使它成為合適的新型候選腫瘤相關(guān)抗原。熱休克蛋白在多發(fā)性骨髓瘤中高表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)水平很低，并且它在骨髓瘤細(xì)胞的生存中起到不可替代的作用。有研究證明腫瘤細(xì)胞中熱休克蛋白90復(fù)合物是活化并且具有高親和力，而在正常組織中則處于失活狀態(tài)，這也使得熱休克蛋白成為腫瘤治療的優(yōu)良靶點(diǎn)。
　　 我們假設(shè)在骨髓瘤細(xì)胞中廣泛高表達(dá)的熱休克蛋白是骨髓瘤細(xì)胞的抗凋亡分子，并將其作為骨髓瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)共分為三

6、個(gè)部分：第一部分，篩選熱休克蛋白來源HLA-A0201限制性CTL表位肽；第二部分，體外驗(yàn)證細(xì)胞毒性T細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；第三部分，建立原代多發(fā)性骨髓瘤SCID-rab動(dòng)物模型并驗(yàn)證熱休克蛋白特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的抗骨髓瘤作用。
　　 第一部分篩選熱休克蛋白來源HLA-A0201限制性CTL表位肽并驗(yàn)證其免疫原性
　　 目的：篩選熱休克蛋白來源HLA-A0201限制性表位肽并驗(yàn)證其免疫原性。
　

7、　 方法：用肽積分系統(tǒng)(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)對熱休克蛋白27、熱休克蛋白70及熱休克蛋白90α來源的HLA-A0201限制性CTL表位肽進(jìn)行預(yù)測，用(http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com)系統(tǒng)對預(yù)測結(jié)果確認(rèn)。合成出積分最高的四條肽段，用HLA-A0201+T2雜交瘤細(xì)胞驗(yàn)證肽段的親和力及穩(wěn)定性，進(jìn)一步篩選出親和力及穩(wěn)定性最佳的兩條肽段用

8、來誘導(dǎo)肽段特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生。合成HLA-A0201-肽段四聚體用以檢測Hsp-CTLs細(xì)胞陽性率。最后，我們給HLA-A0201轉(zhuǎn)基因小鼠接種所篩選的熱休克蛋白肽段，兩周后處死小鼠取脾臟細(xì)胞，檢測是否有熱休克蛋白特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生并驗(yàn)證這些細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能。
　　 結(jié)果：通過積分系統(tǒng)我們預(yù)測并挑選出積分最高的4條肽段，分別是熱休克蛋白27相關(guān)肽段aa27，序列為RLFDQAFGL；熱休克蛋白70相關(guān)肽段aa39

9、3，序列為LLLLDVAPL；熱休克蛋白90相關(guān)肽段aa362，序列為KLYVRRVFI；熱休克蛋白90α相關(guān)肽段aa670,序列為ALLSSGFSL。通過進(jìn)一步T2細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)，我們篩選出結(jié)合力和穩(wěn)定性最強(qiáng)的兩條肽段aa27及aa670。我們通過四聚體檢測健康供者及患者體內(nèi)aa27及aa670特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞水平，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)aa27及aa670四聚體陽性細(xì)胞毒性T細(xì)胞水平較健康供者上升，證明篩選合成的肽序列為生理狀態(tài)下產(chǎn)生的表位

10、肽片段。
　　 結(jié)論：所篩選的熱休克蛋白肽段aa27及aa670與HLA-A0201分子親和力最高，結(jié)合后穩(wěn)定性最強(qiáng)，并且在患者體內(nèi)可以檢測到以上肽段特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。將篩選的熱休克蛋白90肽段接種到HLAA0201+轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)后我們檢測到了熱休克蛋白特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，這提示我們篩選的肽段具有免疫原性。
　　 第二部分體外驗(yàn)證細(xì)胞毒性T細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用并研究其特性
　　 目的：通過體外實(shí)驗(yàn)

11、驗(yàn)證細(xì)胞毒性T細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用并了解細(xì)胞毒性T細(xì)胞特性及細(xì)胞毒作用機(jī)制。
　　 方法：用HLA-A0201+健康供者外周血誘導(dǎo)出肽段特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，用HLAA0201+四聚體檢測所肽段特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞水平，用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測細(xì)胞毒性T細(xì)胞表型及其分泌的細(xì)胞因子，用流式細(xì)胞學(xué)及CCK-8方法驗(yàn)證細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖，用乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)及流式細(xì)胞學(xué)方法驗(yàn)證細(xì)胞毒性T細(xì)胞分別對U266、ARH-77、RPMI

12、8226、LP1細(xì)胞株及骨髓瘤原代細(xì)胞、HLA-A0201+健康供者PBMC的殺傷作用，用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能。
　　 結(jié)果：將外周血單個(gè)核細(xì)胞與肽段沖擊過的自體樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)四周后，在共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中可以檢測到比例逐漸上升的四聚體陽性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其比例由共培養(yǎng)前的不足1％上升到超過20％，這些淋巴細(xì)胞的表型也從低表達(dá)CD45RO高表達(dá)CD45RA轉(zhuǎn)換為高表達(dá)CD45RO低表達(dá)CD45RA，并且分泌IF

13、N-γ。我們將肽段沖擊過的DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)并與未經(jīng)過肽段沖擊過的DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)作為對照，用CCK-8測試發(fā)現(xiàn)與肽段沖擊DC共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞明顯增殖，而另一組沒有增殖。我們將與肽段沖擊過DC共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞分別與HLA-A020+骨髓瘤細(xì)胞株及HLA-A0201-骨髓瘤細(xì)胞株共培養(yǎng)并設(shè)置空白對照，發(fā)現(xiàn)與ARH-77(HLA-A0201+)細(xì)胞共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯增殖，而與LP1(HLA-A0201-)共培養(yǎng)及未與腫瘤細(xì)

14、胞共培養(yǎng)的兩組淋巴細(xì)胞無增殖現(xiàn)象。將這些淋巴細(xì)胞與不同細(xì)胞株、原代細(xì)胞或PBMC共培養(yǎng)后通過乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)及流式細(xì)胞學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)其對HLA-A0201+細(xì)胞株U266、ARH-77及HLA-A0201+骨髓瘤原代細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用，而對HLA 0201-的細(xì)胞株RPMI8226、LP1及來自健康供者的HLA 0201+PBMC沒有細(xì)胞毒作用，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在殺傷過程中CD8+的CTL細(xì)胞表達(dá)CD107α水平明顯上升，并且細(xì)胞毒作用

15、通過perforin及granzyme B途徑發(fā)揮作用。
　　 結(jié)論：熱休克蛋白肽段aa27及aa670可以誘導(dǎo)出該肽段HLA0201+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并且具有細(xì)胞活性，對HLA-A0201+的骨髓瘤細(xì)胞株及骨髓瘤原代細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，并通過Perforin及granzyme B機(jī)制起作用。
　　 第三部分驗(yàn)證Hsp-CTLs在原代多發(fā)性骨髓瘤動(dòng)物模型SCID-rab中的抗骨髓瘤效應(yīng)
　　 目的：建立SCID-

16、rab原代多發(fā)性骨髓瘤動(dòng)物模型并驗(yàn)證Hsp-CTLs在動(dòng)物體內(nèi)的抗骨髓瘤作用。
　　 方法：給10只6-8周雄性CB.17-SCID小鼠植入4周齡新西蘭兔四肢扁骨，4-6周后將當(dāng)天分離好的骨髓瘤患者原代CD138+骨髓瘤細(xì)胞注射入已植入的骨腔中，每周留取小鼠血樣并檢測輕鏈水平，每周進(jìn)行X線照射觀察植入兔骨變化，判斷是否成瘤及決定治療時(shí)機(jī)。成瘤后即開始按照分組情況通過鼠尾靜脈注射Hsp-CTLs細(xì)胞。腫瘤注射起開始計(jì)算生存期，至腫

17、瘤面積達(dá)到225mm2算作死亡。用脫頸方法處死腫瘤達(dá)到225mm2小鼠，取瘤組織行病理學(xué)免疫組化檢測。小鼠全部死亡后計(jì)算生存期。
　　 結(jié)果：在注射CD138+原代骨髓瘤細(xì)胞的9只SCID-rab小鼠中，4只成瘤，成瘤率44.4％。成瘤小鼠生存時(shí)間為49-70天，較未成瘤小鼠明顯縮短，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.05。接受Hsp-CTLs細(xì)胞治療后，HLA-A0201+荷瘤小鼠生存期延長，但因例數(shù)較少，尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。