辣椒素及其受體TRPV1預(yù)防肥胖的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的： 肥胖是指由于機(jī)體能量代謝失衡，熱量攝入大于消耗而導(dǎo)致體脂的過量沉積。肥胖不僅是一種代謝異常，還是高血壓、2型糖尿病、心血管疾病、腦卒中等多種疾病的重要危險(xiǎn)因素，是代謝綜合征(metabolicsyndrome，MS)的主要組成成分和病理生理基礎(chǔ)?？刂品逝郑瑴p少體脂聚集可降低心血管疾病的危險(xiǎn)性和發(fā)病率。 目前針對(duì)肥胖的各種防治手段各有優(yōu)劣，還并不理想。而根據(jù)人們的日常經(jīng)驗(yàn)和零星文獻(xiàn)報(bào)道，食用辣椒具有一定的減肥

2、效果。辣椒中的主要辣味成分辣椒素(capsaicin)在減少體脂聚集、調(diào)節(jié)血脂及能量代謝等方面也有積極的作用。但是介導(dǎo)辣椒素減肥作用的分子機(jī)制和信號(hào)通路并不清楚，辣椒素對(duì)肥胖及肥胖相關(guān)性疾病有無(wú)改善作用也需要進(jìn)一步明確。 辣椒素在體內(nèi)的特異性受體是香草醛受體1(vanilloidreceptor,VR1)，又稱瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1(transientreceptorpotentialvanilloidsubfamilyme

3、mber1，TRPV1)。TRPV1最早發(fā)現(xiàn)于感覺神經(jīng)元中，被認(rèn)為是各種傷害性刺激的分子整合器，但在脂質(zhì)調(diào)節(jié)和肥胖發(fā)生中的可能作用還未見報(bào)道。TRPV1受體是辣椒素在體內(nèi)發(fā)揮生理功能的必經(jīng)通道。作為非選擇性鈣通道，TRPV1的活化可導(dǎo)致[Ca2+]i濃度升高，而[Ca2+]i與肥胖及肥胖相關(guān)疾病聯(lián)系密切，可能TRPV1受體通過[Ca2+]i調(diào)控一系列參與脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的分子，從而介導(dǎo)了辣椒素的減肥機(jī)制。 為了明確TRPV

4、1受體介導(dǎo)的減肥作用和分子機(jī)制，本研究分別于在體和離體水平對(duì)上述推論進(jìn)行探討。研究分為三個(gè)部分：1、制作高脂高糖誘導(dǎo)的小鼠肥胖模型；觀察辣椒素在減輕肥胖、改善肥胖相關(guān)疾病和抑制3T3-L1向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用；2、肥胖狀態(tài)下或3T3-L1分化過程中TRPV1受體在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)改變，并觀察TRPV1受體阻斷(分別用TRPV1受體拮抗劑和RNAi的方法)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟的影響，從而明確TRPV1受體在肥胖發(fā)生發(fā)展中

5、的作用；3、從[Ca2+]i角度和分子水平觀察TRPV1受體對(duì)脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝和能量消耗過程的影響，初步探討TRPV1受體介導(dǎo)減肥的分子機(jī)制。 材料方法： 整個(gè)研究分在體和離體實(shí)驗(yàn)兩部分。在體試驗(yàn)以高脂高糖誘導(dǎo)的肥胖小鼠作為模型，離體研究則在3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)行。 1.應(yīng)用高脂高糖喂養(yǎng)制作C57BL/6J小鼠的飲食誘導(dǎo)性肥胖模型；應(yīng)用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素和地

6、塞米松共同誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。 2.常規(guī)方法檢測(cè)各組小鼠的體重變化，肥胖、糖脂代謝以及心血管結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)指標(biāo)；石蠟切片HE染色，圖像分析系統(tǒng)測(cè)量脂肪細(xì)胞面積大小和觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況。 3.油紅染色光鏡觀察誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞中脂滴聚集情況，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定細(xì)胞中甘油三脂含量。 4.TRPV1受體阻斷分別應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法和使用TRPV1受體特異性拮抗劑辣椒卓平(cap

7、sazepin，CPZ)。 5.檢測(cè)腸系膜脂肪組織和3T3-L1細(xì)胞中各種分子(TRPV1、PPARγ、SREBP-1、UCP2、UCP3和FAS)的蛋白表達(dá)用WesternBlot方法；檢測(cè)TRPV1mRNA表達(dá)情況用RT-PCR方法。 6.比率熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)辣椒素刺激下3T3-L1細(xì)胞和誘導(dǎo)成熟的脂肪細(xì)胞中[Ca2+]i的升高幅度。 結(jié)果： 1.高脂高糖飼料喂養(yǎng)的小鼠體重增加，體脂增多，血脂和胰島素

8、水平升高，脂肪細(xì)胞面積增大，肝臟脂質(zhì)沉積，心血管系統(tǒng)有心肌和小血管重構(gòu)、血壓升高、主動(dòng)脈舒張功能降低等表現(xiàn)；加用辣椒素后使體重減輕，體脂減少，甘油三脂和胰島素降低，脂肪細(xì)胞面積減小和肝臟脂質(zhì)沉積減少，改善主動(dòng)脈舒張功能和心肌、血管重構(gòu)。并使誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞中脂滴減少和甘油三酯含量降低。 2.肥胖個(gè)體的腸系膜脂肪組織和誘導(dǎo)成熟的3T3-L1細(xì)胞中，TRPV1蛋白和mRNA表達(dá)均降低；應(yīng)用辣椒素可上調(diào)TRPV1蛋白和mRNA的表達(dá)

9、。阻斷TRPV1受體(用TRPV1受體拮抗劑和RNAi的方法)可使誘導(dǎo)分化的3T3-L1細(xì)胞中脂滴顯著增多，甘油三脂含量進(jìn)一步升高，促進(jìn)細(xì)胞分化過程，并使辣椒素的減肥和抗脂作用減弱。 3.辣椒素可呈劑量依賴性地升高3T3-L1細(xì)胞的[Ca2+]i；TRPV1受體阻斷(用TRPV1受體拮抗劑和RNAi的方法)后的3T3-L1細(xì)胞在辣椒素刺激下，[Ca2+]i的升高幅度不明顯。 4.飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠和誘導(dǎo)成熟的脂肪細(xì)胞中，

10、PPARγ、UCP2、UCP3和FAS表達(dá)增多而SREBP-1表達(dá)減少；辣椒素可逆轉(zhuǎn)PPARγ、SREBP-1和FAS的表達(dá)改變，但進(jìn)一步促進(jìn)UCP2和UCP3的表達(dá)。應(yīng)用TRPV1受體拮抗劑使辣椒素對(duì)上述分子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用減弱。在TRPV1-RNAi的成熟脂肪細(xì)胞中，以上幾種分子的表達(dá)改變更加顯著，但辣椒素對(duì)上述蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用顯著減弱。 結(jié)論： 1.高脂高糖喂養(yǎng)可誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠發(fā)生肥胖，并出現(xiàn)血脂紊亂、血

11、壓升高、胰島素抵抗、心血管結(jié)構(gòu)和功能異常以及脂肪肝等表現(xiàn)，具有與人類肥胖癥患者的臨床特征相似，可作為肥胖及肥胖相關(guān)性疾病研究的良好模型。 2.辣椒素可明顯減輕飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重，減少體脂聚集，并改善心肌和血管重構(gòu)，改善血管舒張功能，糾正糖脂代謝紊亂。提示辣椒素具有減輕飲食誘導(dǎo)的肥胖并改善肥胖相關(guān)疾病的作用。 3.辣椒素受體TRPV1在脂肪組織和3T3-L1脂肪細(xì)胞中都有表達(dá)，其表達(dá)量隨著個(gè)體的肥胖或3T3-L1細(xì)胞的

12、分化成熟而同步下降；辣椒素可使TRPV1受體表達(dá)上調(diào)；阻斷TRPV1受體可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的成熟分化，并使辣椒素的減肥和抗脂作用減弱。提示TRPV1受體介導(dǎo)了辣椒素的減肥作用；TRPV1受體與肥胖密切聯(lián)系，可抑制前脂肪細(xì)胞向成熟細(xì)胞的分化，在脂肪細(xì)胞分化過程中起著重要的負(fù)向調(diào)控作用。 4.TRPV1受體的活化導(dǎo)致[Ca2+]i的迅速升高，并引起細(xì)胞內(nèi)PPARγ、SREBP-1、UCP2、UCP3和FAS等多種肥胖相關(guān)因子的表達(dá)改變，