開菲爾源干酪乳桿菌產(chǎn)膽鹽水解酶的研究.pdf

1、為探討乳酸菌降膽固醇機理并為開發(fā)降膽固醇的益生菌和益生菌制品提供前期理論基礎(chǔ)，本研究以開菲爾為材料，開展了產(chǎn)膽鹽水解酶菌株的篩選、鑒定、膽鹽水解酶合成條件的優(yōu)化、膽鹽水解酶的提取純化及酶學(xué)特性研究。 1.以開菲爾粒為試材，經(jīng)MRS固體培養(yǎng)基分離純化到86株純菌落；將其在膽固醇為唯一碳源的Ⅰ號培養(yǎng)基上初篩后發(fā)現(xiàn)15株具有降解膽固醇能力；再以含?；悄扄}和膽固醇的MRS瓊脂培養(yǎng)基復(fù)篩得到一株產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株KTx，其降解膽固醇能力達

2、到32.86％。菌株KTx經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化指標和Biolog全自動微生物鑒定儀鑒定為干酪乳桿菌。 2.以MRS、MRS肉湯培養(yǎng)基、改良MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察了培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)膽鹽水解酶活力的影響，結(jié)果確定了MRS肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)。近而對菌株KTx在MRS肉湯培養(yǎng)基中最適碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基起始pH值、刺激因子做了單因素試驗，得出最適碳源為葡萄糖、最適氮源為大豆蛋白胨、最適培養(yǎng)溫度37℃、最適培養(yǎng)基起始pH值5.5～

3、6.0、最適刺激因子吐溫80。在此基礎(chǔ)上選擇葡萄糖、大豆蛋白胨、培養(yǎng)溫度、接種量進行L16(44)四因素四水平正交試驗，結(jié)果表明對膽鹽水解酶活力影響因子水平為：葡萄糖＞大豆蛋白胨＞培養(yǎng)溫度＞接種量。最佳產(chǎn)膽鹽水解酶條件為：葡萄糖4％，大豆蛋白胨2％，培養(yǎng)溫度37℃，接種量2％。優(yōu)化后菌株的產(chǎn)酶活力可提高到優(yōu)化前的13.4倍。 3.經(jīng)硫酸銨分級沉淀、透析、陰離子交換樹脂對膽鹽水解酶進行純化。結(jié)果表明70％的硫酸銨條件下酶蛋白能最大

4、沉淀。采用DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換樹脂層析，以流速1.0ml/min，用含0.1mol/LNaCl-50mmol/L磷酸緩沖液(pH6.5)，即可洗脫下膽鹽水解酶活性峰，比活力可達到1259.84(AU/mg)，純度是原粗酶液的17倍。經(jīng)純化后的樣品SDS-PAGE電泳圖譜只顯示一條蛋白帶，根據(jù)marker分子量大小，初步確定了膽鹽水解酶的分子量約30kDa。 4.在酶學(xué)性質(zhì)研究方面，通過實驗確定膽