AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞治療肝癌的實驗研究.pdf

1、第一部分:AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞并鑒定其功能。
　　方法:采集基因型HLA-A0201的健康志愿者單核細胞，制備負載AFP158-166表位肽的成熟樹突狀細胞(DC)，體外激活T細胞通過流式分選建立AFP158-166特異性T細胞克隆，獲取并擴增AFP158-166特異性TCR基因，構(gòu)建AFP158-166特異性TCR慢病毒載體，感染多克

2、隆T細胞建立AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞。通過MHC五聚體檢測轉(zhuǎn)基因T細胞比例，以ELISPOT和細胞毒性實驗進行功能鑒定。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建AFP158-166特異性TCR慢病毒載體VAT，可轉(zhuǎn)染多克隆T細胞使其表達AFP158-166特異性TCR，構(gòu)建AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞;(2) FCM檢測Pr05 AFP158-166-MHC五聚體和CD8雙陽性細胞比例為1.8％;(3) EL

3、SPOT檢測顯示AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞中分泌IFN-γ的細胞數(shù)是DC誘導(dǎo)的AFP158-166特異性T細胞中的1.8倍。(4)細胞毒性實驗顯示AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞較DC誘導(dǎo)的AFP158-166特異性T細胞對AFP+人肝癌細胞HepG2殺傷作用在效靶比10∶1，20∶1，30∶1時分別從6.3±1.3％，17.9±5.2％，39.2±3.7％上升至11.3±2.9％，27.9±7.8％，62

4、.7±10.4％，而對AFP細胞無明顯殺傷作用。
　　結(jié)論:AFP158-166特異性TCR慢病毒載體VAT可轉(zhuǎn)染多克隆T細胞構(gòu)建AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞，對AFP+人肝癌細胞有特異性殺傷作用。
　　第二部分:AFP158-166抗原肽與IL-15協(xié)同表達人工抗原遞呈細胞的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建AFP158-166抗原肽與IL-15協(xié)同表達人工抗原遞呈細胞并鑒定其功能。
　　方法:以AFP158

5、-166抗原表位肽和IL-15協(xié)同表達質(zhì)粒，構(gòu)建慢病毒載體VA15轉(zhuǎn)染人B細胞淋巴瘤細胞B JAB，以放射輻照抑制增殖，建立安全且穩(wěn)定表達IL-15并遞呈AFP158-166表位肽的人工抗原遞呈細胞，通過ELISA、FCM和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分別鑒定IL-15、MHC分子、CD80、CD86、AFP158-166抗原肽的穩(wěn)定表達，于體外誘導(dǎo)AFP158-166抗原特異性T細胞增殖，并以細胞毒性實驗進行功能鑒定。
　　結(jié)果:(1)成

6、功構(gòu)建AFP158-166抗原表位肽和IL-15協(xié)同表達慢病毒載體VA15，可轉(zhuǎn)染BJAB細胞，獲得協(xié)同表達AFP158-166抗原表位肽和IL-15的BJAB細胞單克隆BA15;(2) BA15可穩(wěn)定表達AFP158-166抗原肽和IL-15;(3)20Gy劑量的137Csγ射線輻照可誘導(dǎo)凋亡有效阻滯BA15細胞增殖但不會使其迅速死亡;(4)20Gy劑量的137Csγ射線輻照不會影響B(tài)A15細胞表面MHC分子及協(xié)同刺激分子CD80、C

7、D86的表達。(5) BAI5可有效激活擴增AFP158-166抗原特異性T細胞，其功能較負載AFP158-166的DC無明顯差異;(6)細胞毒性實驗顯示BA15誘導(dǎo)的AFP158-166特異性T細胞較DC誘導(dǎo)的AFP158-166特異性T細胞對AFP+人肝癌細胞HepG2殺傷作用在各效靶比無明顯差異。
　　結(jié)論:構(gòu)建AFP158-166抗原肽與IL-15協(xié)同表達人工抗原遞呈細胞可有效激活A(yù)FP158-166特異性T細胞，對AFP

8、+人肝癌細胞有特異性殺傷作用。
　　第三部分 AFP158-166特異性轉(zhuǎn)基因T細胞過繼性免疫治療的實驗研究
　　目的:以AFP158-166抗原肽與IL-15協(xié)同表達人工抗原遞呈細胞BA15體外刺激AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞鑒定其功能變化。
　　方法:體外非特異性激活HLA-0201健康志愿者淋巴細胞，以AFP158-166特異性TCR慢病毒VAT感染，制備AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細

9、胞，并以本實驗建立的AFP158-166抗原肽與IL-15協(xié)同表達人工抗原遞呈細胞BA15刺激擴增，通過MHC五聚體檢測轉(zhuǎn)基因T細胞比例變化，以細胞毒性實驗進行體外實驗功能鑒定。利用HepG2肝癌細胞NOD/SCID小鼠模型，進行AFP158-166特異性T細胞過繼免疫治療實驗，觀察治療效果。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)BA15刺激，AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞中Pro5 AFP158-166-MHC五聚體和CD8雙陽性細

10、胞比例從1.8％上升至4.2％，CD8+T細胞/CD4+T細胞比例由0.42上升至1.10，但對AFP+人肝癌細胞HepG2的殺傷作用無明顯變化。(2) AFP158-166特異性TCR轉(zhuǎn)基因T細胞較負載AFP158-166表位肽DC誘導(dǎo)的AFP158-166特異性T細胞對于HepG2肝癌細胞NOD/SCID小鼠模型具有更好的治療效果。
　　結(jié)論:AFP158-166抗原肽與IL-15協(xié)同表達人工抗原遞呈細胞BA15體外刺激AFP