自然殺傷細(xì)胞在病毒性肝衰竭中的作用及趨化機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景及目的】
　　暴發(fā)型肝衰竭(fulminanthepaticfailure,FHF)是一種以肝損傷和功能障礙為主的臨床疾病,起病急、病情危重、癥狀及并發(fā)癥表現(xiàn)多樣,死亡率高。暴發(fā)型肝衰竭的發(fā)病率和病因因地理區(qū)域的不同而異。病毒性肝炎及藥物或毒素的攝入是其最常見的病因,全身免疫系統(tǒng)的激活是其最重要的病因。
　　自然殺傷(NK)細(xì)胞在乙肝病毒感染導(dǎo)致的肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。NK細(xì)胞作為天然免疫重要的效應(yīng)細(xì)

2、胞之一,是抗病毒感染的第一道防線。CD69屬于外源凝集素的C-型超家族,它作為NK細(xì)胞活化的觸發(fā)分子,同時(shí)也是NK細(xì)胞早期表達(dá)的細(xì)胞表面的活化標(biāo)志。在病毒感染中,獼猴NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性被證實(shí)與CD69的表達(dá)相關(guān)。有研究表明,CD69的上調(diào)與NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和IFN-γ的產(chǎn)生相關(guān)。在我們前期研究中,發(fā)現(xiàn)MHV-3感染Balb/cJ小鼠后,肝損傷的嚴(yán)重程度與肝臟NK細(xì)胞的活化有關(guān),但肝臟CD69+NK細(xì)胞在病毒誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中的作用

3、及其機(jī)制研究則較少。在本研究中,我們將進(jìn)一步研究肝臟CD69+NK細(xì)胞在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中的作用。同時(shí),在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),在MHV-3介導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝炎模型中,肝臟NK細(xì)胞的比例和數(shù)量顯著增加,在感染48h達(dá)到峰值,隨后至小鼠死亡仍保持著較高比例,相反在脾臟和骨髓,NK細(xì)胞比例和數(shù)量在感染后均顯著減少。盡管外周血NK細(xì)胞的比例在感染后顯著增加,但其數(shù)量卻顯著減少,表明MHV-3感染后,NK細(xì)胞從脾臟,骨髓和外周血遷移募

4、集至肝臟。然而,在此過程中NK細(xì)胞趨化募集的機(jī)制仍不明確。在實(shí)驗(yàn)前期,我們利用基因芯片技術(shù),篩選出具有差異表達(dá)的肝臟NK細(xì)胞趨化因子受體CCR5、CCR1、CXCR3以及CXCR4。而后,在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭小鼠模型中,我們檢測(cè)了肝臟NK細(xì)胞表面趨化受體CCR5、CCR1、CXCR3和CXCR4的mRNA的表達(dá)水平隨感染時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。綜合前期基因芯片結(jié)果,肝臟NK細(xì)胞表面趨化因子受體CCR5較其余三種受體在本模型中的mRNA

5、表達(dá)水平發(fā)生了更為顯著及平穩(wěn)的變化。因此為了進(jìn)一步深入研究肝臟NK細(xì)胞在病毒誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭模型中的募集機(jī)制,我們對(duì)小鼠病毒性肝炎發(fā)病過程中趨化因子受體CCR5對(duì)NK細(xì)胞的趨化機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　CCR5是趨化因子受體G-蛋白偶聯(lián)受體超家族的子類成員,廣泛表達(dá)于NKT細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,NK細(xì)胞等多種細(xì)胞。它主要包含三個(gè)趨化因子配體:MIP-1α,MIP-1β和RANTES,也被稱為CCL-3,CCL-4和CC

6、L-5,與之共同調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。大量的研究表明CCR5在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要的作用:在暴發(fā)型肝衰竭患者的肝組織活檢中,肝臟CCR5配體(MIP-1α,MIP-1β和RANTES)的表達(dá)量增加,但CCR5及其配體對(duì)在暴發(fā)型肝衰竭中的作用機(jī)制仍不明確。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CCR5在MHV-3導(dǎo)致的暴發(fā)型肝衰竭中可能通過趨化募集外周NK細(xì)胞至肝臟,從而引起肝細(xì)胞壞死及繼發(fā)性肝損傷。
　　因此,本研究的目的如下:
　　(1)肝臟CD

7、69+NK細(xì)胞在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中的具體作用。
　　(2)CCR5和其相應(yīng)的趨化因子配體(CCL3/MIP-1α,CCL4/MIP-1β和CCL5/RANTES)在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭中對(duì)NK細(xì)胞遷移募集的具體機(jī)制。
　　【研究方法】
　　1.采用MHV-3腹腔途徑感染Balb/cJ小鼠建立暴發(fā)型肝衰竭模型。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)MHV-3感染0,24,48和72h后Balb/cJ小鼠肝

8、臟、脾臟、外周血和骨髓中NK細(xì)胞CD69表達(dá)的百分率。肝臟CD69+NK細(xì)胞與肝損傷水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)MHV-3感染0,24,48和72h后CD69+NK細(xì)胞及CD69-NK細(xì)胞功能性標(biāo)記(CD107a),活化性和抑制性受體(NKG2D和NKG2A)的表達(dá)量。胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)其促炎細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α及IL-9)的表達(dá)水平。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MHV-3感染0,12,24,4

9、8和72h后Balb/cJ小鼠肝臟、脾臟、外周血和骨髓中NK細(xì)胞CCR5表達(dá)的百分率。肝臟免疫熒光雙染法檢測(cè)CCR5+NK細(xì)胞在MHV-3感染后在肝臟的遷移募集情況。
　　5.ELISA和免疫組化法用于檢測(cè)MHV-3感染0,12,24,48和72小時(shí)后CCR5配體(MIP-1α,MIP-1β和RANTES)在肝臟的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR用于檢測(cè)在MHV-3感染0,24,48和72小時(shí)后肝細(xì)胞MIP-1α,MIP-1β和RANTE

10、S的mRNA表達(dá)水平。
　　6.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)是用來證實(shí)MHV-3感染的肝細(xì)胞對(duì)脾臟NK細(xì)胞的趨化作用,以及CCR5和其相應(yīng)的趨化因子(MIP-1α,MIP-1β和RANTES)在脾臟NK細(xì)胞遷移至肝臟中的作用。
　　7.轉(zhuǎn)移過繼實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估將脾臟CCR5+NK細(xì)胞或CCR5-NK細(xì)胞通過尾靜脈注射至MHV-3感染NK細(xì)胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,小鼠的生存時(shí)間的改變。轉(zhuǎn)移過繼實(shí)驗(yàn)24小時(shí)后,HE染色用于觀

11、察小鼠肝臟活組織病理改變;測(cè)定血清ALT和AST水平用于評(píng)估肝損傷水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞在肝臟的絕對(duì)計(jì)數(shù)。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1.肝臟NK細(xì)胞CD69的表達(dá)在感染后48小時(shí)(61.37±4.18％對(duì)0.92±0.12%,P<0.0001)顯著增加,在感染后72小時(shí)達(dá)到最高(86.52±2.97%對(duì)0.92±0.12%,P<0.0001)。與此相似的是,脾臟和骨髓中NK細(xì)胞CD69的表達(dá)在感染后48小時(shí)也顯著增加(2

12、6.63±3.40%對(duì)1.37±0.42%,P=0.0193,脾臟;16.97±3.67%對(duì)0.80±0.12%,P=0.0454,骨髓),均在感染后72小時(shí)達(dá)到最高(66.13±6.49%對(duì)1.37±0.42%,P=0.0111,脾臟;29.13±4.09%對(duì)0.80±0.12%,P=0.0191,骨髓)。此外,外周血中NK細(xì)胞CD69的表達(dá)與肝臟趨勢(shì)一致,在感染72小時(shí)達(dá)到最高(6.40±0.44%對(duì)1.16±0.09%,P=0.0

13、077),但在感染48小時(shí)增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.血清ALT水平在感染后48小時(shí)顯著增加,并于感染后72小時(shí)達(dá)到最高(11880.0±1174.0IU/ml對(duì)23.0±1.53IU/ml,P<0.0001),AST于感染后72小時(shí)達(dá)到最高(23907±1199.0IU/ml對(duì)78.33±8.25IU/ml,P<0.0001)。感染后ALT及AST水平與肝臟NK細(xì)胞CD69的表達(dá)呈高度正相關(guān)(相關(guān)性分別為r=0.989和r=0.

14、971),且均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。
　　3.CD69+NK細(xì)胞上CD107a表達(dá)量在MHV-3感染48小時(shí)增加(4.67±0.38%,P<0.001),72小時(shí)達(dá)到最高(12.8±0.8%,P<0.001)。NKG2D在感染48小時(shí)增加(2.48±0.67%,P<0.001),72小時(shí)達(dá)到最高(4.18±0.57%,P<0.001;NKG2A在感染后24小時(shí)CD69-NK細(xì)胞上增加(0.85±0.21%,P<0.

15、001),而后下降。IFN-γ的表達(dá)水平在感染48小時(shí)增高(3.2±0.73%,P<0.001),在72小時(shí)達(dá)到最高(3.45±0.93%,P<0.001);而TNF-α和IL-9水平在MHV-3感染48小時(shí)達(dá)到最高(10.83±0.70%和4.1±1.23%分別代表TNF-α和IL-9,P<0.001)。
　　4.MHV-3感染后,CCR5+NK細(xì)胞在肝臟中的百分率顯著增加,與正常對(duì)照組相比,在感染后24小時(shí)達(dá)到高峰(41%,P

16、=0.0013)。與此相反,CCR5+NK細(xì)胞的脾臟和骨髓的百分率分別為40%和36%,均在感染后12小時(shí)達(dá)到峰值,隨后下降。在外周血中CCR5+NK細(xì)胞與肝臟趨勢(shì)相同,在24小時(shí)達(dá)到峰值(31%)而后下降。將FITC-標(biāo)記的抗小鼠CD3或CD49b和PE標(biāo)記的抗小鼠CD195(CCR5)用于肝臟連續(xù)切片的免疫熒光染色。CD3-CD49b+CCR5+細(xì)胞代表CCR5+NK細(xì)胞。在感染早期(24小時(shí)),CCR5+NK細(xì)胞為肝臟主要浸潤(rùn)的炎

17、性細(xì)胞,而后其他炎性細(xì)胞(如T細(xì)胞)遷移至肝臟。這些結(jié)果表明,在MHV-3感染后早期CCR5+NK細(xì)胞從脾、骨髓和血液遷移募集至肝臟。
　　5.ELISA法用于檢測(cè)MIP-1α,MIP-1β和RANTES在肝臟中的表達(dá),在感染后均逐漸上升,并于感染后72小時(shí)達(dá)到峰值,分別為94ng/ml(MIP-1α),0.8ng/ml(MIP-1β),和160ng/ml(RANTES)。免疫組化染色亦證明感染后72小時(shí)MIP-1α,MIP-1β

18、和RANTES在肝臟中的表達(dá)量最高。感染后的肝細(xì)胞MIP-1α,MIP-1β,RANTESmRNA的表達(dá)呈上升趨勢(shì),至72小時(shí)分別上升269倍,2015倍和189倍。這些結(jié)果表明MHV-3感染后,CCR5配體趨化因子的表達(dá)在肝臟顯著增加,于此同時(shí),CCR5+NK細(xì)胞由外周器官趨化募集至肝臟。
　　6.MHV-3感染的肝細(xì)胞能趨化脾臟NK細(xì)胞,不僅這種趨化效應(yīng)能被抗CCR5的單克隆抗體阻斷,而且可以被抗MIP-1α,抗MIP-1β,

19、和抗-RANTES單克隆抗體分別阻斷,但只有后兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Transwell細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)證明,MHV-3感染的肝細(xì)胞能趨化脾臟NK細(xì)胞,同時(shí)CCR5和其相應(yīng)的趨化因子(MIP-1β,RANTES)在此趨化過程中發(fā)揮了重要作用。
　　7.過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)將脾臟CCR5阻斷的NK細(xì)胞經(jīng)尾靜脈回輸至MHV-3感染已將NK細(xì)胞耗竭的Balb/cJ小鼠后,可將生存時(shí)間延長(zhǎng)至84-90h。HE染色證實(shí)過繼實(shí)驗(yàn)
　　24小時(shí)后,C

20、CR5+NK過繼組大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞死亡,血清ALT/AST水平均高于CCR5-NK過繼組,肝臟NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)亦顯著增高。這些結(jié)果提示阻斷NK細(xì)胞上CCR5的表達(dá)可降低MHV-3感染后肝臟NK細(xì)胞趨化募集,從而減輕肝損傷,表明在FHF中CCR5在NK細(xì)胞的趨化募集方面起了重要的作用。
　　【結(jié)論】
　　1.在病毒誘導(dǎo)的肝衰竭模型中,Balb/cJ小鼠肝臟中CD69+NK細(xì)胞比例顯著增加,于感染后72小時(shí)達(dá)到最高,在脾

21、臟,骨髓及外周血中也有相同的趨勢(shì)。CD69在肝臟NK細(xì)胞中的表達(dá)水平與肝損傷的嚴(yán)重程度(血清ALT及AST水平)呈正相關(guān)。肝臟CD69+NK細(xì)胞表達(dá)功能性標(biāo)志(CD107a),活化性受體(NKG2D),以及胞內(nèi)因子(IFN-γ、TNF-α和IL-9)的水平在感染后48-72小時(shí)顯著上調(diào),而抑制性受體(NKG2A)的表達(dá)量則在感染早期CD69-NK細(xì)胞中相對(duì)增加。由此我們推測(cè),肝臟CD69+NK細(xì)胞通過提高脫顆粒及細(xì)胞毒性作用,增加炎性細(xì)

22、胞因子的產(chǎn)生參與肝細(xì)胞損傷,從而在暴發(fā)型肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中起了重要的作用。
　　2.在病毒誘導(dǎo)的肝衰竭模型中,趨化因子MIP-1α,MIP-1β,RANTES在肝臟感染過程中持續(xù)增加,CCR5+NK細(xì)胞從脾臟、骨髓和血液趨化募集至肝臟,并在感染后24小時(shí)達(dá)到高峰。Transwell細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)表明感染的肝細(xì)胞能趨化脾臟NK細(xì)胞,并且這種效應(yīng)能被抗CCR5的單克隆抗體阻斷;中和MIP-1β和RANTES,亦可降低對(duì)脾臟NK細(xì)胞的趨化