單核-巨噬細胞在肝衰竭中的作用及調節(jié)機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 肝衰竭是多種因素引起的嚴重而廣泛的肝細胞死亡，導致肝臟本身合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機制障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床證候群。肝衰竭內科綜合治療效果不佳，預后差，病死率高，嚴重威脅患者的生命健康，影響社會穩(wěn)定。肝衰竭的發(fā)病機制復雜，已成為肝病學的研究熱點。在肝衰竭發(fā)生和發(fā)展過程中，天然免疫系統(tǒng)的單核/巨噬細胞起了重要作用。巨噬細胞在各免疫細胞中的比例

2、、免疫功能狀態(tài)以及釋放炎癥因子的類型決定著肝臟局部炎癥狀態(tài)，最終影響肝衰竭的臨床特點和結局。若能深入研究肝衰竭進程中肝臟巨噬細胞的表型及功能改變，早期抑制巨噬細胞的過度活化，阻止炎癥重癥化，便有可能從源頭上遏制肝衰竭的發(fā)生。目前有關肝衰竭時單核/巨噬細胞功能狀態(tài)的演變規(guī)律以及調節(jié)機制仍不清楚，為此本課題旨在研究單核/巨噬細胞在肝衰竭進程中的動態(tài)表型及功能變化、探討免疫分子高遷移率族蛋白1（high mobility group box

3、protein1，HMGB1）對肝臟巨噬細胞的炎癥免疫調控作用、揭示調節(jié)肝臟巨噬細胞功能的分子靶標及相關信號通路，為肝衰竭早期診斷、預防和治療提供新的思路。
　　 研究方法:
　　 1.體內實驗
　　 經(jīng)小鼠尾靜脈注射ConA（20 mg/kg）制備小鼠急性肝衰竭模型，并于注射后1、3、6、12、24小時處死動物，收集肝組織和外周血，對肝組織進行蘇木素-伊紅染色觀察肝組織病理學改變，同時進行肝功能（丙氨酸氨基轉移

4、酶和天門冬氨酸氨基轉移酶）檢測。分離1、3、6小時組以及正常對照組的外周血單個核細胞和肝臟巨噬細胞，通過流式細胞術檢測外周血Ly6C+CD11b+單核細胞和肝臟F4/80+巨噬細胞的表達頻率，熒光定量PCR檢測肝臟巨噬細胞中TNF-α、IL-6及HMGB1mRNA的表達水平，Annexin V和原位末端轉移酶標記技術檢測肝臟巨噬細胞的凋亡情況，Western blot試驗和免疫熒光激光共聚焦技術檢測肝組織及肝臟巨噬細胞中HMGB1的表達

5、及轉位，同時用ELISA方法檢測血清HMGB1水平。
　　 2.體外實驗
　　 原代分離、培養(yǎng)和鑒定正常小鼠來源的肝臟巨噬細胞，用HMGB1-siRNA干擾細胞中HMGB1的表達，給予ConA5μg/ml體外誘導培養(yǎng)24小時后，流式細胞儀檢測MHCⅡ的表達，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液TNF-α及IL-6水平，同時用Western blot檢測MAPK通路相關蛋白（ERK和p38 MAPK）的磷酸化水平。
　　

6、 3.臨床研究
　　 采自63例慢性輕/中度乙型肝炎、39例慢加急性肝衰竭（早期）、27例HBV攜帶者及18例健康對照者的血清，病例組和對照組在年齡、性別方面均無顯著生差異(P＞0.05），用ELISA方法檢測HBV血清標記物和血清HMGB1水平，同時檢測血清病毒學指標、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素和凝血酶原活動度，并分析血清HMGB1與各肝功能指標之間的相關性。
　　 研究結果:
　　 1.

7、體內實驗結果
　　 (1)肝衰竭進程中，外周血炎癥性Ly6C+CD11b+單核細胞亞群在總CD11b+單核細胞中的比例逐漸增高。
　　 (2)肝臟巨噬細胞表達TLR4和MHCⅡ的水平以及TNF-α和IL-6 mRNA水平在肝衰竭早期明顯增高，后期呈減少趨勢。
　　 (3)肝衰竭進程中，肝臟巨噬細胞在肝臟單個核細胞中的比例逐漸減少，同時細胞的凋亡率增加。
　　 (4)血清及肝組織HMGB1的水平隨著疾病進展

8、而明顯增加，呈現(xiàn)時間依賴效應。
　　 (5)肝臟巨噬細胞中HMGB1的表達在肝衰竭早期明顯增高，部分HMGB1蛋白從胞核轉移至胞漿，后期可釋放至細胞外，而且表達呈減少趨勢。
　　 2.體外實驗結果
　　 (1)經(jīng)HMGBI-siRNA干擾后，受Con A刺激的肝臟巨噬細胞中MHCⅡ的表達水平仍升高，與對照-siRNA組比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　 (2)經(jīng)HMGB1-siRNA干擾后，受ConA

9、刺激的肝臟巨噬細胞釋放TNF-α及IL-6減少，與對照-siRNA組比較有明顯差異（P＜0.05）。
　　 (3) Con A刺激后，肝臟巨噬細胞中ERK and p38 MAPK蛋白的磷酸化水平升高，經(jīng)HMGB1-siRNA干擾后，可以顯著減輕以上兩個信號蛋白的磷酸化水平，與對照-siRNA組比較有明顯差異（P＜0.05）。
　　 3.臨床研究結果
　　 (1)輕/中度乙型肝炎和慢加急性肝衰竭（早期）患者血清中

10、HMGB1的水平明顯高于HBV攜帶者及健康對照者（P＜0.05），輕/中度乙型肝炎組和慢加急性肝衰竭（早期）組之間也有明顯差異（P＜0.05）。
　　 (2)慢性乙型肝炎患者血清HMGB1水平與ALT/AST水平及血清總膽紅素水平成正相關性（P＜0.05），與凝血酶原活動度成負相關性（P＜0.05）。
　　 研究結論:
　　 (1)肝臟巨噬細胞在Con A誘導的小鼠急性肝衰竭的不同階段表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài):早期，