CD200-CD200R通路在人骨髓間充質(zhì)干細胞調(diào)節(jié)樹突狀細胞中的作用.pdf

1、目的:骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell，BM-MSC)是一種非造血系成體多能干細胞，能夠抑制T細胞、NK細胞活性，影響B(tài)細胞擴增，抑制樹突狀細胞(dendritic cell,DC)的分化及成熟。近年一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSC能夠減低GVHD發(fā)生風險甚至治療急性GVHD，其減輕GVHD反應的機制可能通過抑制DC的成熟及抗原提呈功能。樹突狀細胞作為功能最強的抗原提呈細

2、胞，在移植免疫中發(fā)揮關鍵作用。間充質(zhì)干細胞能夠抑制DC的分化、成熟及抗原提呈功能，其機制主要包括可溶性因子及細胞間接觸等兩個方面?？扇苄砸蜃邮荕SC調(diào)節(jié)DC功能的重要機制，但部分研究表明細胞間接觸途徑可能也起到重要的作用。
　　 CD200是近年新發(fā)現(xiàn)的與免疫排斥相關的分子，廣泛表達于多種細胞。Kawasaki等人發(fā)現(xiàn)，CD200表達于骨髓間充質(zhì)干細胞。Khatri等發(fā)現(xiàn)，CD200R存在于DC上，CD200與CD200R通路通

3、過細胞間接觸，傳遞抑制信號，阻止DC成熟，抑制DC介導的免疫反應。由此設想，抑制性免疫調(diào)控分子CD200是BM-MSC抑制DC成熟及功能的作用機制之一。研究BM-MSC相關的細胞間接觸途徑，能夠更全面了解BM-MSC的作用機制，有利于在造血干細胞移植中發(fā)揮BM-MSC抑制aGVHD的作用，提高移植療效。
　　 第一部分 CD200分子在人骨髓間充質(zhì)干細胞上的表達
　　 方法:1.分離、培養(yǎng)、鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞，并采用F

4、ACS及RT-PCR方法檢測P2-P6 BM-MSC的CD200表達。2.將不同來源PBMCs中加入PHA，建立體外免疫應答模型，并將BM-MSC加入其中，72小時后FACS檢測BM-MSC表面CD200表達的變化。3.實驗結果以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS11.5軟件包，均數(shù)間比較采用OneWay ANOVA檢驗。檢驗水準α=0.05。
　　 結果:1.CD200在BM-MSC P2-P5呈逐漸增加趨勢，至P6表達增加明顯，

5、 FACS檢測CD200陽性率分別為P2(17.35％±10.38％,n=11)、P3(26.35％±19.79％，n=11)、P4(34.20％±21.29％，n=11)、P5(40.44％±26.28％，n=11)、P6(50.19％±26.29％,n=11)；P2與P6差異明顯(P=0.007)，且與性別、年齡(P＞0.05)無關。RT-PCR方法檢測CD200 RNA量相對表達率分別為P2(0.33％±0.26％,n=5)、P3

6、(0.48％±0.52％,n=7)、P4(0.88％±0.68％,n=8)、P5(1.34％±0.96％,n=7)、P6(1.99％±1.74％,n=7)；P2與P6差異明顯(P=0.008)。2.PHA刺激PBMC活化增殖，酶標儀檢測各孔吸光度(OD值)，PBMC+PHA組高于PBMC組([0.83±0.04] vs[0.44±0.01]，P=0.000)，MSC+PBMC+PHA組高于MSC+PBMC組([0.62±0.03]vs[

7、0.44±0.01]，P=0.000)。而與MSC+PBMC組相比，PHA刺激PBMC活化增殖后促進MSC表面的CD200分子表達上調(diào)([44.842±12.958]vs[33.742±7.938]，P=0.017)。
　　 第二部分 CD200-CD200R通路在BM-MSC調(diào)節(jié)DC功能中的作用
　　 方法:1、分離人外周血PBMC，參照髓樣DC培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基中加入IL-4/GM-CSF，培養(yǎng)第5天得未成熟樹突狀細胞

8、(imDC，高表達CD1a，低表達CD14)，再加入LPS，第7天得成熟樹突狀細胞(mDC，高表達CD83、CD86)。在DC培養(yǎng)的第1天加入表達CD200的BM-MSC，部分實驗組加入抗CD200阻斷性抗體，培養(yǎng)第5天FACS檢測imDC免疫表型。2、在DC培養(yǎng)的第5天加入表達CD200的BM-MSC，部分實驗組加入抗CD200阻斷性抗體，然后加入LPS，第7天收獲成熟樹突狀細胞，F(xiàn)ACS檢測mDC免疫表型：混合淋巴細胞反應檢測mDC

9、對PBMC增殖的影響；ELISA法檢測mDC培養(yǎng)上清中IL-12的濃度。3、取同株不同CD200陽性率BM-MSC P2/P5(P2 CD200陽性率小于25％，P5 CD200陽性率大于80％)與imDC共培養(yǎng)，加入LPS，第7天收獲mDC。檢測項目參照實驗2。4、應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，兩組以上組間資料比較采OneWay ANOVA檢驗。檢驗水準α=0.05

10、。
　　 結果;1與單純PBMCs組相比，BM-MSCs與PBMCs共培養(yǎng)5天后，細胞表面分子未趨向imDC表型：(CD14：[35.13％±14.75％]vs[5.05％±3.66％]，P=0.005；CD1a：[11.15％±5.22％]vs[79.86％±4.59％]，P=0.000)。而加入抗CD200阻斷性抗體，不影響MSC抑制PBMC向imDC分化的作用，imDC表面免疫分子未發(fā)生明顯變化(CD14：[48.25％±

11、12.57％]vs[35.13％±14.75％]，P=0.138；CD1a：[10.52％±12.91％]vs[11.15％±5.22％]，P=0.919)。2在imDC向mDC成熟階段加入BM-MSC，則mDC表面共刺激分子表達降低：(CD83：[46.34％±6.77％]vs[78.31％±6.51％]，P=0.002；CD86：[81.42％±8.61％]vs[94.04％±2.62％]，P=0.026)；對PBMC的刺激能力減弱

12、(OD值：[0.767±0.036]vs[0.944±0.017]，P=0.000)；分泌IL-12減少([216pg/ml±12pg/ml]vs[346pg/ml±7pg/ml]，P=0.000)。同時加入抗CD200阻斷性抗體，則mDC成熟表型表達較BM-MSC抑制組有所增加(CD83：[65.95％±13.28％]vs[46.34％±6.77％]，P=0.039; CD86：[92.96％±3.42％]vs[81.42％±8.61

13、％]，P=0.04)；對PBMC增殖的刺激能力增強(OD值：[0.859±0.024]vs[0.767±0.036]，P=0.001)；分泌的IL-12增加([272pg/ml±13pg/ml]vs[216pg/ml±12pg/ml]，P=0.000)。3取同株不同CD200陽性率的BM-MSC與imDCs共培養(yǎng)，加入LPS誘導imDC成熟。與CD200低表達組相比，CD200高表達組mDC成熟標記表達減弱：(CD83：[55.58％±

14、0.46％]vs[68.81％±8.49％]，P=0.017；CD86.[74.34％±1.28％]vs[81.86％±3.27％]，P=0.005)；對PBMCs增殖的抑制率減弱(OD值：[0.773±0.011]vs[0.870±0.004]，P=0.000)；分泌細胞因子有所減弱(IL-12：[226±6.8]ng/L vs[272±8.0]ng/L，P=0.001)。
　　 結論:1 CD200分子在骨髓間充質(zhì)干細胞表達