彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SUDHL2中CD44ICD存在的意義及其作用機(jī)理的初步探討.pdf

1、研究背景：
　　 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma，NHL)中最常見的類型之一，占成人淋巴瘤的30％-40％。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，中國(guó)的發(fā)病率更高，約占56％，并且發(fā)病率逐年上升。DLBCL具有一定的侵襲性并且高度異質(zhì)，在臨床中予標(biāo)準(zhǔn)的CHOP或是R-CHOP化療，也只能使大約一半的病人獲得完全緩解，因此如何提高難治復(fù)發(fā)性

2、DLBCL的緩解率是臨床工作中面臨的巨大挑戰(zhàn)。國(guó)際預(yù)后指數(shù)(InternationalPrognosticIndexIPI)是臨床工作中普遍采用的預(yù)后指標(biāo)，但是因DLBCL的高度異質(zhì)性，使IPI評(píng)分難以對(duì)其預(yù)后做出準(zhǔn)確判斷。目前普遍采取的分型是通過cDNA微陣列和寡核苷酸技術(shù)，對(duì)比未激活B細(xì)胞、體外激活B細(xì)胞以及正常生發(fā)中心B細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜做出的分型:生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinalcenterB-cell-like，GCB)和活

3、化B細(xì)胞樣(activated-B-ceil-like，ABC)和第三型。其中GCB型化療效果好，患者預(yù)后佳，ABC型對(duì)化療反映敏感度欠佳，預(yù)后差。
　　 研究表明腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞表面的粘附分子密切相關(guān)。CD44是一種跨膜型粘附分子，廣泛表達(dá)與正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面，參與腫瘤細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、凋亡等調(diào)控。我們前期的研究也證明，CD44與DLBCL預(yù)后密切相關(guān)。CD44H或CD44v6表達(dá)的DLBCL患者預(yù)后差。CD4

4、4由信號(hào)肽、N-末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-末端胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域四個(gè)功能區(qū)組成，分子大小為80-90KD。CD44分子的跨膜段含有兩個(gè)早老因子依賴的酶切位點(diǎn)，近胞漿一側(cè)的位點(diǎn)水解脫落，形成大約12-16KD的CD44胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(CD44intracellulardomain，CD44ICD)，隨后可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa-B(nucleartranscriptionfactorκB)等，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 細(xì)

5、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，相對(duì)分子量分別為42KD和44KD，是脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，使脯氨酸相鄰的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化。是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)家族成員之一。當(dāng)其被激活發(fā)生磷酸化后，進(jìn)入細(xì)胞核作用于多種轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)

6、。過度活化的ERK1/2與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。
　　 Notch受體蛋白是由Notch基因編碼的一種跨膜蛋白，由胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段組成。哺乳動(dòng)物中存在4種Notch受體:Notch1-4。當(dāng)配體與Notch受體結(jié)合后，能夠產(chǎn)生兩次蛋白水解反應(yīng)。當(dāng)γ-分泌酶作用其跨膜區(qū)時(shí)，發(fā)生第二次水解反映，釋放出游離的Notch蛋白包內(nèi)段(NICD)。NICD穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。有文獻(xiàn)報(bào)道如果使

7、Notch-1受體表達(dá)下調(diào)，可以使NF-κB及其靶基因失活，抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡。
　　 DAPT是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，是目前公認(rèn)的Notch受體抑制劑，能有效抑制其水解，阻斷其信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。同時(shí)DAPT也能抑制CD44水解出CD44ICD，進(jìn)而影響相關(guān)信號(hào)通路。我們前期的試驗(yàn)表明，當(dāng)加入10uM的DAPT后，CD44ICD和NF-κB的表達(dá)明顯受抑制，同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道，D

8、APT能使CD44的表達(dá)量下調(diào)，因此，我們并不能明確CD44陽(yáng)性的ABC-DLBCL細(xì)胞株予DAPT處理后，NF-κB的下降究竟是何者引起:是因?yàn)镃D44ICD的表達(dá)下降引起還是由于Notch信號(hào)通路被阻斷所引起。
　　 研究目的：
　　 利用現(xiàn)有的ABC-DLBCL細(xì)胞株，通過Westernblot的方法，明確各細(xì)胞株CD44ICD的細(xì)胞亞定位，進(jìn)而觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。并且探討DAPT、Notch信號(hào)通路和CD44

9、三者之間的關(guān)系，明確抑制CD44ICD的產(chǎn)生所產(chǎn)生的蛋白水平的改變，是Notch信號(hào)通路和CD44兩者之中的哪一個(gè)起主導(dǎo)作用，同時(shí)觀察CD44ICD被阻斷后，對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，并為尋找提高DLBCL的緩解率的新方法做提供一些基礎(chǔ)資料。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞株:ABC-DLBCL細(xì)胞株SUDHL2、OCI-Ly3;
　　 2、檢測(cè)細(xì)胞表面CD44蛋白的表達(dá):流式細(xì)胞儀檢測(cè)SUDHL2、OCI-Ly3細(xì)胞株中

10、CD44的表達(dá)情況;
　　 3、用不同濃的的DAPT分別處理兩株細(xì)胞，24、48、72h后，瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44、CD19、CD20的表達(dá)情況;AnnexinV-FITC聯(lián)合PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Real-timePCR檢測(cè)Notch-1、CD44ICD基因表達(dá)的變化;
　　 4、用不同濃度的DAPT處理CD44陽(yáng)性的的細(xì)胞株1h后，檢測(cè)ERK1/2及磷酸化ERK1/2的表達(dá)情

11、況;
　　 5、所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;計(jì)量資料采用X±S表示。如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用析因設(shè)計(jì)和One-WayANOVA進(jìn)行分析，如果數(shù)據(jù)成偏態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、CD44的表達(dá)水平流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩細(xì)胞株SUDHL2、OCI-Ly3細(xì)胞表面CD44的表達(dá)，其表達(dá)水平分別為98.86％±1.56％、3.

12、66％±3.72％;
　　 2、Notch-1受體在Sudh12細(xì)胞株的表達(dá)在SUDHL2細(xì)胞株中可檢測(cè)到Notch-1受體的表達(dá);
　　 3、DAPT對(duì)SUDHL2細(xì)胞株的形態(tài)及CD44、CD19、CD20表達(dá)的影響予0、0.1、1.0、5、10umol/L的DAPT分別作用SUDHL2細(xì)胞株，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，不同濃度的DAPT對(duì)CD44(F=0.371，P=0.826)、CD19(F=0.164，P=0.954)、

13、CD20(F=0.049，P=0.995)抗原的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;DAPT作用不同的時(shí)間，CD44(Z=-1.445，P=0.148)、CD19(Z=0.148，P=0.688)、CD20(F=2.494，P=0.130)抗原表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;濃度和時(shí)間的交互相應(yīng)對(duì)三者的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.371、0.164、0.049，P=0.826、0.954、0.995)。
　　 4、DAPT對(duì)CD44ICD、

14、和Notch-1基因表達(dá)的影響不同濃度的DAPT分別作用24h、48h、72h后，不同濃度的DAPT對(duì)CD44ICDmRNA(F=0.001，P=1.000)、Noteh-1mRNA(F=0.623，P=0.650)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;DAPT作用不同的時(shí)間，CD44ICDmRNA(F=0.189，P=0.828)、Notch-1mRNA(F=2.830，P=0.73)表達(dá)量差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;濃度和時(shí)間的交互

15、相應(yīng)對(duì)兩者的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.002、0.368、0.049，P=1，000、0.926)
　　 5、DAPT對(duì)SUDHL2細(xì)胞凋亡的影響不同濃度的DAPT作用SUDHL2細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的凋亡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.747，P=0.166);不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SUDHL2細(xì)胞凋亡差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((x)2=1.249，P=0.539));濃度與時(shí)間不存在交互效應(yīng)(F=0.801，P=0.607);
　　 6

16、、ERK1/2及磷酸化ERK1、2的檢測(cè)WesternBloting檢測(cè)SUDHL2細(xì)胞株中存在ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表達(dá)，予不同濃度的DAPT處理SUDHL2細(xì)胞1h后，ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表達(dá)量沒有明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 1、γ-分泌酶抑制劑DAPT不能抑制SUDHL2細(xì)胞株中CD44的表達(dá)，并且對(duì)CD19、CD20的表達(dá)量無(wú)影響，對(duì)SUDHL2細(xì)胞株形態(tài)無(wú)明顯改變。