穩(wěn)定低表達(dá)CD44的ABC型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin'slymphoma，NHL）中最常見的一種，約占成人NHL的30％～40％，為一組臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)、免疫表型和遺傳學(xué)都具有明顯異質(zhì)性的淋巴瘤。這種異質(zhì)性還體現(xiàn)在對治療反應(yīng)的不一致以及預(yù)后的差異。40％～50％的DLBCL患者可通過傳統(tǒng)的聯(lián)合化療達(dá)到持續(xù)緩解，其余的則常表現(xiàn)為原

2、發(fā)耐藥或緩解后復(fù)發(fā)。如何通過各種因素判斷患者預(yù)后，早期干預(yù)治療，是DLBCL治療成功的關(guān)鍵。國際預(yù)后指標(biāo)(internationalprognosticindex，IPI)對判斷DLBCL的預(yù)后具有重大的指導(dǎo)意義，但它并不能反映腫瘤發(fā)生過程中的分子生物學(xué)本質(zhì)。運(yùn)用基因芯片技術(shù)，根據(jù)DLBCL基因表達(dá)譜(GEP)的差異，可以將DLBCL分為三型:預(yù)后較好的生發(fā)中心B細(xì)胞樣亞型(GCB)，外周血活化B細(xì)胞樣亞型(ABC)，以及第3型(typ

3、e3)。有趣的是GCB-DLBCL和ABC-DLBCL的預(yù)后明顯不同，GCB-DLBCL接受化療的效果較好，而ABC-DLBCL化療效果不佳。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因，目前尚不明確，但基因表達(dá)譜的差異可能是DLBCL患者預(yù)后不同的原因之一，因此尋找不同蛋白在兩種類型DLBCL的表達(dá)差異可能幫助我們找到不同的預(yù)后指標(biāo)。
　　 CD44是一種重要的細(xì)胞膜表面粘附分子，也是透明質(zhì)酸的主要受體。在淋巴系統(tǒng)中，其功能與淋巴細(xì)胞的歸巢、激活及凋亡

4、密切相關(guān)。CD44在B細(xì)胞激活時表達(dá)增加，然而在進(jìn)入生發(fā)中心后表達(dá)下降。隨著B細(xì)胞的進(jìn)一步成熟，生發(fā)中心的后代細(xì)胞如記憶細(xì)胞和漿細(xì)胞會再度表達(dá)CD44和其它歸巢受體，以促進(jìn)B細(xì)胞的再循環(huán)和歸巢。Sabine等研究發(fā)現(xiàn)CD44V主要表達(dá)于NON-GCB型的DLBCL患者，此類患者采用標(biāo)準(zhǔn)的CHOP化療方案預(yù)后不良。HorstE等證實(shí)結(jié)外的DLBCL和侵襲性DLBCL都與CD44的高水平表達(dá)有關(guān)，也提示預(yù)后不佳。因此，CD44可能是提示DL

5、BCL分型及預(yù)后的新指標(biāo)。目前關(guān)于CD44在ABC-DLBCL細(xì)胞聚集、遷移、增殖和生存過程中發(fā)揮的作用及其可能的分子機(jī)制目前尚不清楚。
　　 本研究以ABC-DLBCL細(xì)胞株SUDHL2為研究對象，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建干擾CD44表達(dá)shRNA病毒載體，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入ABC-DLBCL細(xì)胞株，建立穩(wěn)定低表達(dá)CD44的ABC-DLBCL細(xì)胞株，并進(jìn)一步研究CD44沉默對ABC-DLBCL細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響

6、。
　　 材料和方法：
　　 1、分別針對3個靶點(diǎn)設(shè)計干擾人CD44的shRNA序列，化學(xué)合成相關(guān)序列，并與慢病毒載體連接，獲得重組載體pGFP-shCD44。
　　 2、將重組載體pGFP-shCD44質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，挑選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。從擴(kuò)大培養(yǎng)的DH5α細(xì)菌中提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切及測序鑒定，證實(shí)shRNA序列的正確連接。
　　 3、重組載體

7、以脂質(zhì)體法（LipofectamineTM2000）轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞Phoenix293細(xì)胞中，48h于熒光顯微鏡下查看GFP表達(dá)情況。分別于48h和72h時收集病毒上清轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞SUDHL2，轉(zhuǎn)染后120h后進(jìn)行流式分選，將GFP+細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況并檢測GFP陽性率，提取總RNA，行RT-PCR驗(yàn)證CD44基因在轉(zhuǎn)染重組載體pGFP-shCD44的細(xì)胞株中是否沉默。
　　 4、擴(kuò)大培養(yǎng)成功沉默C

8、D44的SUDHL2細(xì)胞株，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT、流式細(xì)胞術(shù)及Transwell等方法檢測表達(dá)CD44基因?qū)UDHL2細(xì)胞株的增殖、細(xì)胞周期及遷移等的影響。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)分析:結(jié)果采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，細(xì)胞遷移率單因素均數(shù)比較若方差齊使用One-WayANOVA方差分析，LSD方法進(jìn)行多重比較;若方差不齊則使用采用近似F檢驗(yàn)（Welch方法）代替方差分析后采用DunnettT3方法進(jìn)行多重比較;MTT多因

9、素均數(shù)比較使用析因設(shè)計方差分析進(jìn)行統(tǒng)計;計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pGFP-shCD44直接測序證實(shí)與設(shè)計的shRNA序列相符。
　　 2、以脂質(zhì)體法將重組載體pGFP-shCD44轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞Phoenix293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h后于熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光。分別于48h、72h收集病毒上清。病毒上清轉(zhuǎn)染目的細(xì)

10、胞SUDHL2后72h進(jìn)行流式分選，擴(kuò)大培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下可見大量GFP表達(dá)，將GFP陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并提取總RNA，RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)CD44基因在SUDHL2細(xì)胞株中被沉默。
　　 3、CD44相關(guān)基因的RT-PCR結(jié)果顯示:SUDHL2、SUDHL2+pGFP和SUDHL2+pGFP-shCD44細(xì)胞中，Bcl-6、Stat-3及Mum-1均有表達(dá)，且相互之間無明顯差異。
　　 4、細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:

11、SUDHL2細(xì)胞:細(xì)胞胞體較小，呈圓形，邊緣規(guī)則，無突起，漿少量、藍(lán)色，未見顆粒;細(xì)胞核大，染色質(zhì)致密;SUDHL2+pGFP細(xì)胞:細(xì)胞胞體小，呈圓形，邊緣不規(guī)則，可見瘤狀突起，胞漿中等，藍(lán)色，可見少量空泡。染色質(zhì)致密;SUDHL2+pGFP-shCD44細(xì)胞株:細(xì)胞胞體大，呈圓形或橢圓形，胞漿豐富，深藍(lán)色，空泡較多，無顆粒;核大而不規(guī)則，核質(zhì)疏松。
　　 5、MTT結(jié)果顯示:SUDHL2、SUDHL2+pGFP及SUDHL2+

12、pGFP-shCD44三組細(xì)胞間增值率的差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.742，P＜0.001）;0h、24h、48h和72h的OD值進(jìn)行析因設(shè)計的方差分析，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=525.116，P＜0.001);時間和細(xì)胞之間有交互效應(yīng)(F=11.165，P＜0.001)。其中0h時3組間的OD值無明顯差異（P=0.812），24h、48h和72h時均有明顯差異(P=0.013，＜0.001，＜0.001)，結(jié)合多重比較結(jié)果顯示:SUDH

13、L2+pGFP-shCD44細(xì)胞的增值率顯著低于與SUDHL2、SUDHL2+pGFP細(xì)胞株(P＜0.001，＜0.001)。而SUDHL2和SUDHL2+pGFP細(xì)胞株增值率的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.647)。
　　 6、細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果:SUDHL2+pGFP-shCD44和SUDHL2、SUDHL2+pGFP組細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞比例明顯增高。提示CD44沉默誘導(dǎo)了SUDHL2細(xì)胞的凋亡。
　　 7、Trans

14、well實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:方差齊性檢驗(yàn)示方差齊(F=1.531，P=0.290)，三組間的遷移率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=52.672，P＜0.001）。其中SUDHL2+pGFP-shCD44細(xì)胞的遷移率和SUDHL2、SUDHL2+pGFP細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，＜0.001)。由此可見，CD44沉默后SUDHL2細(xì)胞的遷移率降低。
　　 結(jié)論：
　　 我們成功構(gòu)建了干擾CD44表達(dá)的shRNA病毒載