缺血缺氧性視神經(jīng)視網(wǎng)膜損傷的分子機制研究.pdf

1、第一部分 Homer1a在眼部缺血缺氧損傷中的作用
　　1研究背景：
　　眼部缺血缺氧后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生病理改變，可引起視神經(jīng)不可逆的損傷，導致視力損失甚至失明。目前研究發(fā)現(xiàn)，眼部缺血缺氧損傷主要發(fā)生在視網(wǎng)膜動靜脈阻塞、未成熟的視網(wǎng)膜病變、糖尿病性的視網(wǎng)膜病變、青光眼等視網(wǎng)膜血管阻塞所致的缺血性疾病中，表現(xiàn)為組織細胞缺血及缺氧損傷后，細胞正常結(jié)構(gòu)消失、功能破壞等。因此，保護視神經(jīng)、減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞缺血缺氧后損傷等研究

2、具有重要的意義和作用。前期文獻報道提示，Homer1a作為一種重要的突觸后致密物質(zhì)，在創(chuàng)傷性腦損傷中具有重要作用，可通過調(diào)節(jié) Erk信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。也有研究發(fā)現(xiàn)Homer1和眼部疾病密切相關(guān)，但在眼部缺血缺氧損傷后Homer1a的改變與作用尚不明確，仍需進一步研究。本研究的目的是：（1）明確眼部缺血缺氧后Homer1a的表達變化；（2）探討在眼部缺血缺氧后Homer1a對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用及其機制。
　　2方法：

3、r>　?。?）細胞模型：原代培養(yǎng)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，采用氧糖剝奪模型；（2）動物模型：生理鹽水誘導小鼠眼部缺血缺氧模型；（3）蛋白表達：采用Western blot檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞或視網(wǎng)膜中Homer1a、Erk、磷酸化Erk（p-Erk）、剪切的Caspase3（cleaved-Caspase3）、Caspase3等蛋白在缺血缺氧后的表達變化；（4）細胞損傷：TUNEL染色及 Caspase3剪切水平檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡情況

4、，β-III-微管蛋白染色檢測視網(wǎng)膜缺血缺氧后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活情況；（5）藥物干預(yù)：應(yīng)用Erk抑制劑（PD98059）抑制 Erk激活；（6）基因干涉/過表達：采用慢病毒介導的基因干涉/過表達手段調(diào)節(jié)Homer1a表達；（7）基因敲除動物：采用Homer1a基因敲除動物驗證Homer1a神經(jīng)保護作用。
　　3結(jié)果和結(jié)論：
　　本實驗分別使用細胞及動物缺血缺氧模型，通過Western blot、基因干涉/過表達、TUNE

5、L染色、基因敲除等方法，研究Homer1a在眼部缺血缺氧損傷中的表達改變、作用及其機制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，體外視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧糖剝奪或體內(nèi)眼部缺血缺氧損傷后，Homer1a及p-Erk表達水平均顯著升高。在體外實驗中，上調(diào)Homer1a后，p-Erk表達水平顯著下降，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡率明顯降低；而下調(diào)Homer1a蛋白，p-Erk表達水平升高，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率也增高。此外，抑制Erk活性，Home1a表達明顯增加，視網(wǎng)膜神經(jīng)

6、節(jié)細胞凋亡率明顯下降。以上實驗表明，氧糖剝奪損傷后，Homer1a可保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；在相同損傷條件下，p-Erk表達水平和細胞凋亡率有相關(guān)關(guān)系，高表達 p-Erk視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率升高，而低表達p-Erk視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率降低；Homer1a與Erk信號通路相互作用，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。進一步的體內(nèi)實驗表明：小鼠眼部缺血缺氧造模后，Homer1a基因敲除小鼠（KO，Homer1a-/-）視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率及突起連接較野生

7、型小鼠（WT，Homer1a+/+）顯著降低，進一步證實視網(wǎng)膜缺血缺氧損傷后 Homer1a可能有神經(jīng)保護作用。綜上，在眼部缺血缺氧損傷中Homer1a可能通過調(diào)節(jié)Erk信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　第二部分 NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的作用
　　1研究背景：
　　眼部缺血缺氧可導致眼底部神經(jīng)組織不可逆損傷，該種損傷存在于多種眼部疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中。近期研究表明，眼部的缺血缺氧損傷最早發(fā)生在視乳頭區(qū)，眾

8、所周知，視乳頭區(qū)是視神經(jīng)出眼入顱的部位，該部位視神經(jīng)可直接和小膠質(zhì)細胞接觸，當小膠質(zhì)細胞受刺激被激活后，可迅速釋放炎性因子等，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終引起細胞組織損傷。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人的視網(wǎng)膜乳頭區(qū)NLRP3炎性體高表達。NLRP3炎性體作為Caspase1激活的平臺，在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用。但NLRP3炎性體激活并導致神經(jīng)節(jié)細胞損傷的具體機制尚不明確，仍需進一步研究。本研究的目的是：(1)明確NLRP3炎性體在眼部缺

9、血缺氧損傷中的改變與作用；(2)探討NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷后的確切作用機制。
　　2方法：
　　（1）動物模型：聚苯乙烯微球前房注射誘導小鼠眼部缺血缺氧模型；（2）免疫熒光染色：β-Ⅲ-微管蛋白標記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及 Iba1染色標記小膠質(zhì)細胞；（3）分子表達：采用熒光實時定量的方法檢測動物視網(wǎng)膜乳頭區(qū)組織中炎性體相關(guān)蛋白在缺血缺氧后的表達變化。
　　3結(jié)果和結(jié)論：
　　本實驗使用聚苯乙烯微球前房注射

10、誘導小鼠眼部缺血缺氧模型，通過免疫熒光染色、熒光實時定量等方法，研究NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的作用及機制。本研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性體在正常人及小鼠視網(wǎng)膜乳頭區(qū)均高表達。小鼠眼部缺血缺氧損傷后，NLRP3敲除小鼠（KO，NLRP3-/-）及ASC敲除小鼠（KO，ASC-/-）視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率及突起連接較野生型小鼠（C57/BL6J）顯著增加，證實視網(wǎng)膜缺血缺氧損傷后NLRP3炎性體可能在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷中起重要作用

11、。進一步熒光實時定量方法發(fā)現(xiàn)，眼部缺血缺氧損傷后，野生型小鼠（C57/BL6J）視網(wǎng)膜乳頭區(qū)NLRP3炎性體相關(guān)分子Caspase1、IL-1β和IL-18表達顯著升高。以上結(jié)果證明，NLRP3炎性體在小鼠眼部缺血缺氧損傷中，活化小鼠視乳頭區(qū)Caspase1、IL-1β和IL-18等炎性因子。此外，IL-1R敲除小鼠（KO，IL-1R-/-）及IL-18敲除小鼠（IL-18-/-）眼部缺血缺氧損傷后，較野生型小鼠（C57/BL6J），其