布美他尼對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織NMDAR1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：腦缺血再灌注損傷（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury, CIRI）是指腦缺血一定時間再恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)腦功能損害加重的現(xiàn)象。腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，其機(jī)制包括谷氨酸等興奮性氨基酸(Excitatory amino acids，EAAs)的毒性作用，線粒體功能障礙，炎癥介質(zhì)釋放，氧自由基生成，一氧化氮釋放，Ca2+超載，腦水腫，以及血管通透性改變和血腦

2、屏障的破壞等，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)細(xì)胞死亡，多種因素互相影響作用，最終使神經(jīng)功能受損。興奮性氨基酸是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)有重要的功能，但是在腦缺血再灌注損傷后，興奮性氨基酸的過度釋放導(dǎo)致興奮性毒性對腦組織有損害作用。研究表明，腦缺血再灌注后早期興奮性氨基酸釋放增加，過度釋放的興奮性氨基酸通過多種機(jī)制產(chǎn)生興奮性毒性，主要表現(xiàn)在 EEAs作用于 N-甲基-D-天門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor

3、，NMDAR）引起大量的Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載，引起一系列病理生理變化導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，作用于1-氨基-3-羧基-5-甲基-4-異戊丙酸（AMPA）受體等其他谷氨酸受體介導(dǎo)大量的Na+、Cl-及 H2O內(nèi)流，造成腦水腫。NMDAR是最重要的興奮性氨基酸受體，是配體門控型離子通道，包含谷氨酸和甘氨酸結(jié)合位點(diǎn)，已證實有三種亞基：NMDAR1、NMDAR2、NMDAR3，分別有著不同的分布和功能，不同的構(gòu)成及分布都會影響通道的

4、功能。NMDAR1是基本的功能單位，是 Ca2+通道的調(diào)節(jié)者，NMDAR2是調(diào)節(jié)單位，已知有四個亞型，它通過多種方式調(diào)節(jié) NMDAR復(fù)合物的功能活性，NMDAR3在 NMDAR復(fù)合物中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。其中NMDAR1最為重要。腦缺血再灌注損傷后NMDAR1的表達(dá)會發(fā)生變化，有研究表明，腦缺血時，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元NMDAR1表達(dá)迅速上調(diào)，再灌注3h時達(dá)到高峰，表達(dá)量約為正常對照組的5-6倍，然后逐漸下降，24-72小時表達(dá)低于正常，之后恢復(fù)

5、正常；前腦腦缺血再灌注發(fā)現(xiàn)，海馬 CA1區(qū) NMDAR1 mRNA表達(dá)顯著上升，并且在24h達(dá)到最高峰，隨后逐漸下降，到72h后仍稍高于正常水平，直到7天表達(dá)下降至最低水平。有研究報道，腦缺血后NMDAR的變化程度與海馬 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元死亡程度有密切關(guān)系。因此，抑制 NMDAR的表達(dá)或者活性可能會減輕腦缺血后的損傷。研究表明，給予 NMDAR抑制劑可以阻斷NMDAR介導(dǎo)的細(xì)胞外 Ca2+大量內(nèi)流造成的鈣超載，減輕局灶性腦缺血后腦水腫

6、及腦梗死體積，但是NMDAR抑制劑有較多的副作用，限制了臨床使用。布美他尼是一種袢利尿劑，對Na-K-Cl協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+–K+–Cl-Cotransporters，NKCC)高敏感，NKCC有NKCC1和NKCC2兩種亞型，NKCC1分布廣泛，在腦皮質(zhì)細(xì)胞、海馬各區(qū)椎體細(xì)胞高表達(dá)，NKCC2只在腎組織表達(dá)。布美他尼作用于腎 NKCC2具有很強(qiáng)的利尿作用。研究表明，布美他尼可以減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制與抑制腦 NKCC

7、1有關(guān)，我們前期的實驗也證實了布美他尼有減輕腦缺血再灌注損傷的作用，并且機(jī)制可能與抑制 NKCC1減輕腦水腫有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，高鉀可以引起 NKCC1活性增加，細(xì)胞水腫，興奮性氨基酸釋放增加，加入布美他尼能抑制 NKCC1活性，減輕細(xì)胞水腫，同時興奮性氨基酸釋放減少，減少高鉀等引起的興奮性毒性，說明布美他尼對興奮性氨基酸的釋放有影響。興奮性氨基酸釋放的變化會引起受體的變化，目前，布美他尼對腦缺血再灌注損傷后腦組織中NMDAR1是否存在

8、調(diào)節(jié)作用尚未有研究證實。因此，本研究通過建立大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞（MCAO）缺血模型，缺血2h再灌注，在缺血前預(yù)先靜脈注射布美他尼，觀察布美他尼對局灶性腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦組織梗死體積、腦水腫情況及腦組織 NMDAR1表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討布美他尼在局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用及可能的機(jī)制，為局灶性腦缺血再灌注損傷的治療提供新的方法和理論依據(jù)。
　　方法：成年雄性SD大鼠156只，體重為230～280g，隨機(jī)

9、分為假手術(shù)組(S組， n=36)、缺血再灌注組(I/R組，n=60)和布美他尼治療組(B組，n=60)，其中各組再分為缺血再灌注4h、8h、24h三個時間亞組。采用線栓法大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）缺血模型，缺血2h再灌注，建立局灶性腦缺血再灌注模型。S組只分離頸總動脈，不插入栓線，其余步驟相同。B組于缺血前10min經(jīng)尾靜脈注射布美他尼30mg/kg，S組和I/R組注射等容量生理鹽水。在缺血再灌注后4h、8h、24h，觀察大鼠行為學(xué)

10、改變，進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分；I/R組和B組在腦缺血再灌注4h、8h、24h各分別隨機(jī)取5只大鼠，S組分別隨機(jī)取3只，取腦組織行 TTC染色，圖像分析計算腦梗死體積；用干濕重法測量缺血側(cè)腦組織干濕重比，計算腦水含量；取視交叉神經(jīng)起點(diǎn)處前后各2mm的冠狀切片進(jìn)行冰凍切片，免疫組化染色，計算平均光密度值（Mean optical Density，MOD），觀察缺血側(cè)海馬CA1區(qū)NMDAR1的表達(dá)，；取缺血側(cè)皮質(zhì)腦組織進(jìn)行免疫印跡測定皮質(zhì) NM

11、DAR1以及β-actin灰度值，并計算NMDAR1/β-actin比值，分析缺血側(cè)皮質(zhì)NMDAR1的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴大鼠神經(jīng)功能缺陷評分（NDS） S組未見神經(jīng)功能缺陷。I/R組再灌注4h、8h、24h的NDS評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。B組再灌注24h組的NDS評分低于再灌注4h、8h組（P<0.05）。與I/R組比較，B組再灌注24h的NDS評分低于I/R組(P<0.05)。⑵大鼠腦梗死體積測定 S組未見明顯的

12、腦梗死灶，I/R組與B組再灌注4h、8h、24h均有不同程度的腦梗死。組內(nèi)比較，I/R和B組各時間點(diǎn)腦梗死體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與I/R組比較，B組再灌注4h、8h、24h腦梗死體積減少（P<0.05）。⑶大鼠缺血側(cè)大腦的腦含水量變化 S組腦含水量無明顯變化（P>0.05）。與S組比較， I/R組與B組再灌注4h、8h、24h缺血側(cè)腦含水量均明顯升高（P<0.05）。與1/R組比較，B組再灌注4h、8h、24h缺血側(cè)腦含

13、水量均低于1/R組，以8h、24h明顯（P<0.05）。⑷大鼠缺血側(cè)海馬 CA1區(qū) NMDAR1表達(dá) S組各時間點(diǎn)缺血側(cè)海馬CA1區(qū)NMDAR1表達(dá)的MOD值低，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與S組比較，I/R組在缺血再灌注4h、8h、24h時海馬 CA1區(qū) NMDAR1表達(dá)的MOD值均升高(P<0.01)，在24h最明顯，但 B組只在缺血再灌注8h、24h比 S組升高（P<0.01）。與I/R組比較，B組缺血再灌注4h、8h海馬

14、CA1區(qū)NMDAR1表達(dá)的MOD值下降（P<0.01），24h差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。⑸大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)NMDAR1表達(dá)各組皮質(zhì)均有表達(dá)NMDAR1，S組各時間點(diǎn)皮質(zhì) NMDAR1表達(dá)的灰度值無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。I/R組的皮質(zhì) NMDAR1表達(dá)在缺血再灌注4h開始增加，到8h表達(dá)最高，24h開始下降到4h水平,但仍然比S組高(P<0.05)；B組缺血再灌注4h的NMDAR1表達(dá)較S組略為下降（P>0.05），8h、24

15、h灰度值均比 S組高(P<0.05)。與I/R組比較， B組缺血再灌注4h皮質(zhì)NMDAR1表達(dá)的灰度值下降(P<0.05)，8h、24h無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：①大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織的NMDAR1表達(dá)上調(diào)，海馬CA1區(qū)以缺血再灌注24h最為明顯，皮質(zhì)以缺血再灌注8h最為明顯。②在缺血前預(yù)先靜脈注射布美他尼30mg/kg，能減少大鼠海馬 CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)缺血再灌注早期（4h、8h）的NMDAR1表達(dá)。③在