植物乳桿菌胞外多糖發(fā)酵、結(jié)構(gòu)鑒定及其功能特性研究.pdf

1、乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是LAB在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的黏液多糖和莢膜多糖的總稱。由于其獨特的理化性質(zhì)及流變學特性，LAB EPS被作為增稠劑、乳化劑、膠凝劑和穩(wěn)定劑，廣泛的用于食品企業(yè)的生產(chǎn)中。目前的一些研究表明，LAB EPS具有抗腫瘤、增強免疫力、抗炎性、抗病毒、抗突變和抗氧化等功效。由于LAB被公認為是安全的(generally r

2、egardedas safe，GRAS)食品級微生物，因此其產(chǎn)生的EPS也相應地被認為是安全的，可以直接用于食品中。
　　 本論文對從自然發(fā)酵泡菜中篩選到的一株產(chǎn)EPS的LAB進行了鑒定，并對其EPS進行了較系統(tǒng)的研究。主要結(jié)果如下:
　　 1.采用菌落拉絲法這一簡便的篩選技術(shù)從植物源性的天然發(fā)酵制品(泡菜)中篩選到一株高產(chǎn)EPS的LAB70810，通過形態(tài)學觀察、生理生化鑒定、以及分子生物學的手段對該菌株進行了鑒定，最

3、終將菌株70810判定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。以Lb.plantarum70810 EPS的產(chǎn)量為指標，通過單因素優(yōu)化得出結(jié)果分別為:MRS培養(yǎng)基，最佳碳源為蔗糖，蔗糖30 g/L，最佳氮源為大豆蛋白胨，大豆蛋白胨10 g/L，接種量4％，pH6，發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵溫度30℃。通過Plackett-Burman設計對Lb.plantarum70810生產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件共計14個因素

4、進行了優(yōu)化，通過SAS軟件分析得到影響EPS產(chǎn)量的三個主要因素是蔗糖、接種量以及發(fā)酵溫度。對由Plackett-Burman設計篩選出的蔗糖、接種量以及發(fā)酵溫度，采用中心組合設計(CCD)及響應面分析法，得到Lb.plantarum70810發(fā)酵產(chǎn)EPS的最優(yōu)條件為:蔗糖34g/L、接種量5％、發(fā)酵溫度31℃。在此條件下發(fā)酵Lb.plantarum70810實際所得EPS產(chǎn)量為425.16mg/L，與預測值基本吻合。
　　 2.

5、通過Sevag法、三氯乙酸法脫蛋白的效果比較，認為終濃度4％的三氯乙酸法脫蛋白的效果好，蛋白質(zhì)脫除率可達到86.4％。通過單因素試驗分析了Lb.plantarum70810EPS醇沉的最佳條件;采用Box-Behnken的中心組合設計及響應面分析，建立了Lb.plantarum70810 EPS醇沉條件的二次多項式數(shù)學模型。通過模型分析并修正后得到醇沉的最佳工藝參數(shù)為:靜置時間13h、乙醇添加倍數(shù)4倍、發(fā)酵液濃縮倍數(shù)3.50倍。在此條件

6、下進行驗證實驗所得EPS平均提取量為320.17 mg/L。大孔吸附樹脂對Lb.plantarum70810 EPS脫色純化的結(jié)果表明:選擇S-8樹脂，樹脂用量為4％,多糖溶液濃度為2 mg/mL，調(diào)節(jié)多糖溶液的pH值為6.0，在25℃條件下，靜態(tài)吸附4h，脫色率為72.58％，糖保留率為69.15％。經(jīng)S-8樹脂脫色后的粗多糖樣品依次使用DEAE-52和Sephadex G-100進行分級純化后主要得到兩個組分(EPS-1和EPS-2

7、)，采用HPLC法對EPS-1和EPS-2進行純度鑒定和分子量測定，結(jié)果表明，EPS-1和EPS-2為均一的多糖組分，平均相對分子量(Mw)分別為1.75×104和1.20×105 Da。分別采用硫酸-苯酚法、硫酸-間羥基聯(lián)苯比色法、考馬斯亮藍法和氯化鋇-明膠比色法，測定粗多糖、EPS-1和EPS-2中的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和硫酸基的含量，結(jié)果表明，粗多糖、EPS-1、EPS-2的總糖含量分別為76.75％、94.45％、90.55％;

8、糖醛酸含量分別為3.19％、2.09％、1.71％;蛋白質(zhì)含量分別為0.32％、0.82％、1.58％;硫酸基未檢出。
　　 3.通過多種方法對EPS-1和EPS-2的結(jié)構(gòu)特征進行了測定。采用三甲基硅醚衍生化法及氣相色譜法對多糖樣品的單糖組成進行分析，結(jié)果表明，EPS-1單糖組成及摩爾比為葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖=53.24∶10.41∶1.00。EPS-2單糖組成及摩爾比為葡萄糖∶甘露糖∶巖藻糖=3.48∶9.61∶1.00。綜

9、合單糖組成分析、紅外掃描、甲基化反應和NMR分析的結(jié)果，基本可以確定EPS-1是以1→4連接的α-型吡喃葡萄糖、甘露糖為主鏈并含有少量半乳糖的中性多糖。EPS-2是以1→4連接的α-型吡喃葡萄糖為主鏈、以1→2，6連接的甘露糖為支鏈，并含有少量巖藻糖的酸性多糖。
　　 4.透析吸附試驗結(jié)果表明，Lb.plantarum70810 EPS對Pb(Ⅱ)離子的最佳吸附pH為5.0，吸附平衡時間為6h，吸附溫度為30℃。當EPS溶液濃度

10、為5g/L、Pb(Ⅱ)離子濃度在0.1 mg/L到1000 mg/L之間時，隨著初始Pb(Ⅱ)離子濃度的增加，EPS對Pb(Ⅱ)離子的吸附量也增加。EPS用量從0.0005 g(濃度為0.1 g/L)增加到0.001 g(濃度為0.2 g/L)時，其對Pb(Ⅱ)離子的吸附量隨著EPS用量的增加而增加;當EPS用量進一步增加時，其對Pb(Ⅱ)離子的吸附量則逐漸降低。EPS吸附Pb(Ⅱ)離子前后的紅外光譜分析表明，羧基是EPS起吸附作用的主

11、要官能團。
　　 5.采用CCK-8法探討了Lb.plantarum70810胞外粗多糖(Crude EPS)及純化組分EPS-1和EPS-2對人前列腺癌細胞PC-3，人結(jié)腸癌細胞HCT-116，人肝癌細胞HepG2，及人大腸癌細胞HT-29的體外增殖抑制作用。結(jié)果表明，Crude EPS、EPS-1和EPS-2對人前列腺癌細胞PC-3，人結(jié)腸癌細胞HCT-116，人肝癌細胞Hep G2，及人大腸癌細胞HT-29的生長均具有明顯

12、的體外抑制作用，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系和時間-效能關(guān)系。當多糖樣品濃度為400μg/mL時，處理72 h后，Crude EPS、EPS-1和EPS-2對人前列腺癌細胞PC-3的增殖抑制率分別為93.74％、38.54％和39.40％;對人結(jié)腸癌細胞HCT-116的增殖抑制率分別為57.35％、55.01％和57.48％;對人肝癌細胞Hep G2的抑制率分別為96.76％、52.73％和59.76％;對人大腸癌細胞HT-29的抑制率分別為