Bartter綜合征遺傳學(xué)分析與耳聾基因芯片研發(fā).pdf

1、第一部分Ⅳ型Bartter綜合征遺傳學(xué)分析
　　背景:Bartter綜合征(Bartter syndrome，BS)是一組臨床表現(xiàn)為腎性失鹽、低鉀血癥、代謝性堿中毒、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增強(qiáng)的遺傳性疾病，主要為常染色體隱性遺傳。根據(jù)不同的臨床特點(diǎn)，可將BS分為3型:經(jīng)典型BS（包括Gitelman綜合征）、新生兒型BS、新生兒型BS伴感音神經(jīng)性耳聾。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)6個(gè)與BS有關(guān)的常染色體基因:NKCC2、 ROMK、

2、CLCNKB、BSND、CLCNKA、NCCT。根據(jù)遺傳學(xué)的特征，可將BS分為6型:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型，其中Ⅳ型、Ⅴ型為新生兒型伴感音神經(jīng)性耳聾，Ⅵ型為Gitelman綜合征。
　　目的:本研究小組收集了一個(gè)Bartter綜合征的散發(fā)病例，患者同時(shí)伴有感音神經(jīng)性耳聾，擬通過分析臨床特征與基因突變檢測(cè)尋找病因。
　　方法:對(duì)患者及父母進(jìn)行了病史采集、體格檢查及輔助檢查，并選取100名正常人群作為對(duì)照組，進(jìn)行了G

3、JB2、BSND、CLCNKA、CLCNKB等四個(gè)基因的外顯子篩查。
　　結(jié)果:患兒的臨床表現(xiàn)為:新生兒期發(fā)病，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增高，低鉀血癥、低氯血癥，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，神經(jīng)性耳聾，腎臟影像學(xué)無明顯異常，具有羊水過多和早產(chǎn)史，符合Ⅳ型Bartter綜合征的典型癥狀。同時(shí)，患兒的BSND基因第一個(gè)外顯子存在純和突變c.22C＞T和c.127G＞A，GJB2基因存在復(fù)合雜合突變即c.235delC和c.109G＞A。而患

4、兒父母BSND基因均存在雜合突變c.22C＞T和c.127G＞A，父親GJB2基因存在雜合突變c.109G＞A，母親GJB2基因存在雜合突變c.235delC?；純杭案改妇窗l(fā)現(xiàn)CLCNKA和CLCNKB基因的變異。正常對(duì)照組中37例存在BSND c.127位雜合等位基因G/A，2例存在BSND基因c.127位純和等位基因A/A。
　　結(jié)論:1.本研究所報(bào)道的Ⅳ型Bartter綜合征患者同時(shí)攜帶BSND與GJB2基因變異屬世界首次

5、報(bào)道;2.患兒Ⅳ型BS是由BSND基因純和突變c.22C＞T導(dǎo)致，而患兒GJB2基因的復(fù)合雜合突變可能在耳聾發(fā)生過程中有一定的作用;3.患兒攜帶的BSND基因變異c.127G＞A為單核苷酸多態(tài)性。
　　第二部分Goldengate耳聾基因芯片的優(yōu)化設(shè)計(jì)
　　背景:耳聾是最常見的感覺神經(jīng)性疾病，它不僅是造成聽力殘疾、影響人類身心健康的疾病，而且給患者的生活、家庭、工作和學(xué)習(xí)中的交流帶來極大的不便。與此同時(shí)，耳聾也給社會(huì)帶來了沉

6、重的負(fù)擔(dān)。據(jù)報(bào)道，全球有2.5億人患有中度以上聽力損失。耳聾遺傳學(xué)研究表明，人類23對(duì)染色體中的22對(duì)都分布有耳聾遺傳位點(diǎn)，線粒體基因也與耳聾相關(guān)。約有半數(shù)的先天性耳聾與遺傳因素有一定聯(lián)系。隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，逐漸衍生出一些基因診斷手段，然而這些方法無法同時(shí)具備高通量、覆蓋面廣、低成本、高準(zhǔn)確性的特征，因此對(duì)遺傳性耳聾的基因診斷需要進(jìn)行革命性的改革。在本課題組的前期工作中，設(shè)計(jì)了具有384個(gè)位點(diǎn)的Goldengate耳聾基因芯片。其中包括

7、240個(gè)耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)（77個(gè)顯性突變位點(diǎn)及163個(gè)隱性突變位點(diǎn)）和144個(gè)SNP位點(diǎn)。應(yīng)用該耳聾基因芯片對(duì)465個(gè)DNA模板進(jìn)行篩查，統(tǒng)計(jì)分析了芯片Call rate、SNP位點(diǎn)的等位基因頻率。結(jié)果顯示，芯片總Call rate為96.32％; GJB2235delc檢測(cè)位點(diǎn)的假陽(yáng)性率為3.1％，假陰性率為0;對(duì)一個(gè)非綜合征型顯性遺傳耳聾家系進(jìn)行SNP位點(diǎn)的連鎖分析，其結(jié)果與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星定位掃描方法的定位結(jié)果相似，認(rèn)為該芯片具備初步

8、進(jìn)行耳聾相關(guān)基因的排除定位連鎖分析的能力。然而，芯片結(jié)果存在目前不能解釋的疑點(diǎn):第一，初步應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)部分不常見突變位點(diǎn)在檢測(cè)過程中出現(xiàn)較高的陽(yáng)性檢測(cè)率，如PJVK_988delG為57.36％、SLC26A4_Gly497Ser為7.14％;第二，部分位點(diǎn)的call rate較低;第三，部分患者為多種基因突變位點(diǎn)的攜帶者或純合子基因型;第四，部分正常人群的檢測(cè)結(jié)果存在一種或多種突變，但并未有耳聾的表現(xiàn)。基于以上原因，為了獲取具有更高

9、準(zhǔn)確性、更具合理性的芯片，本課題小組擬將芯片進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果優(yōu)化芯片中的耳聾突變檢測(cè)位點(diǎn)及SNP位點(diǎn)。
　　目的:驗(yàn)證第一版Goldengate耳聾基因芯片的準(zhǔn)確性。在符合臨床特點(diǎn)及應(yīng)用的基礎(chǔ)上，根據(jù)第一版芯片的經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化Goldengate耳聾基因芯片，使其符合中國(guó)耳聾人群遺傳學(xué)特點(diǎn)，具有應(yīng)用性與合理性。
　　方法:第一版Goldengate耳聾基因芯片共有384個(gè)位點(diǎn)，隨機(jī)挑選芯片中19個(gè)突變檢測(cè)位點(diǎn)，應(yīng)用S

10、anger測(cè)序法驗(yàn)證其敏感性和特異性。結(jié)合驗(yàn)證結(jié)果優(yōu)化第一版芯片位點(diǎn)。通過文獻(xiàn)檢索法統(tǒng)計(jì)目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的所有耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)，篩選位點(diǎn)時(shí)結(jié)合臨床應(yīng)用，首要原則為:世界范圍內(nèi)突變位點(diǎn)報(bào)道次數(shù)大于2次，以中國(guó)人群報(bào)道次數(shù)較多的位點(diǎn)為主。在滿足第一原則的基礎(chǔ)上，其他輔助原則為:(1)相鄰兩個(gè)位點(diǎn)至少間隔60堿基以上;(2)盡量選擇探針評(píng)分大于0.6的位點(diǎn)，熱點(diǎn)突變位點(diǎn)探針評(píng)分在0.5-0.6之間也可納入芯片;(3)點(diǎn)突變優(yōu)先于長(zhǎng)缺失及插入突

11、變;(4)排除第一版芯片中call rate低于70％的位點(diǎn)。SNP位點(diǎn)的替換原則如下:(1) SNP位于亞洲人群中報(bào)道的已克隆耳聾相關(guān)基因;(2)與以上選取的耳聾致病突變位點(diǎn)間隔60bp及以上;(3) SNP位點(diǎn)探針評(píng)分大于0.6;(4)點(diǎn)突變優(yōu)先于長(zhǎng)缺失及插入突變;(5)剔除第一版芯片中call rate分?jǐn)?shù)低于0.6的SNP位點(diǎn)。將優(yōu)化設(shè)計(jì)后的384個(gè)位點(diǎn)的探針評(píng)分與前期芯片的評(píng)分進(jìn)行t檢驗(yàn)比較，初步判斷芯片位點(diǎn)選擇的合理性。

12、r>　　結(jié)果:1.第一版Goldengate耳聾基因芯片位點(diǎn)的敏感性從0％-100％不等，特異性均為100％;2.優(yōu)化后的第二版耳聾芯片中包含200個(gè)非綜合癥耳聾位點(diǎn)、40個(gè)常見綜合征耳聾位點(diǎn)，以及144個(gè)SNP位點(diǎn);3.耳聾突變位點(diǎn)包含中國(guó)人群最常見的8個(gè)熱點(diǎn)突變，如下: GJB2_1_BP DEL_35delG、 GJB2_1_BP_ DEL_235C、GJB2_2_BP_ DEL_299_300at、 GJB3_Arg180Ter

13、m[C/T]、SLC26A4_Asn392Tyr[A/T] SLC26A4_IVS7_2[A/G]SLC26A4_His723Arg[A/G]、線粒體12rsRNA1555[A/G];4.第二版芯片覆蓋綜合征和非綜合征型耳聾的46個(gè)核基因與線粒體基因;5.兩版芯片探針設(shè)計(jì)評(píng)分進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異;6.第二版芯片位點(diǎn)采用自主性命名，達(dá)到實(shí)用性強(qiáng)、易解讀、易判斷芯片結(jié)果的作用。
　　結(jié)論:1.第一版芯片的特