核糖體展示Anticalin模擬抗體庫(kù)的構(gòu)建及其在雌二醇、百草枯模擬抗體篩選中的應(yīng)用.pdf

1、本論文介紹了核糖體展示（ribosome display）方法用于小分子環(huán)境化學(xué)污染物模擬抗體(anticalin)篩選的原理、實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并以典型環(huán)境化學(xué)污染物雌二醇、百草枯為研究對(duì)象，對(duì)它們的模擬抗體進(jìn)行了活性鑒定。
　　雌二醇是一種小分子甾體類激素,在組織液及血液中的含量可反應(yīng)婦產(chǎn)科、內(nèi)科、內(nèi)分泌科、骨科及腫瘤等多種疾病,具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。因其可以提高畜禽瘦肉比并促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但由于雌二醇可在

2、動(dòng)物組織內(nèi)形成殘留，通過(guò)食物鏈危害人類健康，使男性兒童乳腺發(fā)育呈女性化，男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異?；蛞鸩∽?，女性兒童提前發(fā)育，并導(dǎo)致女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率上升。因此，對(duì)肉及其肉制品中雌二醇的監(jiān)測(cè)是確保廣大市民食用“放心肉”的必要措施。
　　百草枯（Paraquat,PQ）又名克蕪蹤，是一種速效觸殺型滅生性季銨鹽類除草劑，是我國(guó)廣泛使用的除草劑之一。百草枯有效成分為1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽,它在農(nóng)作物中的殘

3、留對(duì)人、獸有毒害作用。百草枯可以經(jīng)胃腸道、呼吸道和皮膚吸收，以導(dǎo)致肺纖維化。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB1633321996規(guī)定:菜籽油、柑桔、成品糧、梨和蘋果中PQ最大允許殘留量分別為0.05、0.2、0.5、0.05和0.05mg/kg。
　　利用核糖體展示抗體庫(kù)庫(kù)容量大、建庫(kù)和篩選方法簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建Anticalin模擬抗體庫(kù)。以脂質(zhì)運(yùn)載蛋白Lipocalin家族之一：膽汁三烯結(jié)合蛋白（bilin-binding protein BBP）

4、基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)包含16個(gè)隨機(jī)突變位點(diǎn)的引物合成Anticalin模擬抗體庫(kù)。同時(shí)引入核糖體展示必需的全部組件，采用引物重疊PCR技術(shù)將Anticalin庫(kù)與組件進(jìn)行拼接，從而構(gòu)建了核糖體展示的Anticalin模擬抗體庫(kù)。將構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯后，以小分子雌二醇、百草枯為靶標(biāo)，利用固相和液相親和方法篩選抗雌二醇、百草枯抗體。通過(guò)改變Mg2+濃度將篩選到的模擬抗體-核糖體-mRNA三聯(lián)復(fù)合體解離，獲得模擬抗體所對(duì)應(yīng)的mRNA