ICOS分子的克隆表達(dá)及ICOS核糖體單鏈抗體庫的構(gòu)建及篩選.pdf

1、本研究旨在應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選出與人誘導(dǎo)共刺激分子(induciblecostimulator，ICOS)特異性結(jié)合的單鏈抗體，以期獲得的抗ICOS單鏈抗體能更好的應(yīng)用于抑制急慢性免疫排斥治療。
　　從Jurkat細(xì)胞中得到ICOS分子的基因，經(jīng)雙酶切嵌入表達(dá)載體pET28a并經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)。
　　以原核表達(dá)純化的ICOS蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，每隔兩周免疫一次，共免疫4次，并通過ELISA進(jìn)行小鼠免

2、疫抗體效價的鑒定。免疫后，取小鼠的脾臟提取總RNA，并設(shè)計兼并引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增小鼠的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈k。通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)，經(jīng)linker DNA連接構(gòu)建抗ICOS的單鏈抗體庫。
　　從構(gòu)建的抗ICOS的單鏈抗體庫中，應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選抗ICOS的單鏈抗體。所構(gòu)建的單鏈抗體庫，經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄翻譯后，形成“單鏈抗體-核糖體-mRNA”三元復(fù)合物，并以此進(jìn)行體外篩選。先以BAFF-His蛋白

3、負(fù)篩，再以ICOS為抗原進(jìn)行正篩。經(jīng)過三輪篩選，RT-PCR擴(kuò)增單鏈抗體片段，并嵌入到pET43.1a表達(dá)載體中。經(jīng)鑒定為陽性的重組子轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)正確的單克隆，進(jìn)行間接ELISA檢測，鑒定與ICOS高結(jié)合率的單克隆抗體株。得到的高結(jié)合單鏈抗體株，通過鎳柱親和純化得到單鏈抗體，并經(jīng)過Western blot鑒定其特異性。
　　我們以ICOS蛋白為抗原進(jìn)行核糖體展示篩選，經(jīng)過