AAV9-SERCA2a基因不同方法轉染SD大鼠心肌持效性及安全性評價.pdf

1、目的：構建滴度1×1012 vg/mL的rAAV9-hSERCA2a-EGFP病毒載體系統(tǒng)，研究不同心臟基因轉染方法轉染AAV9-SERCA2a基因對SD大鼠心肌的持效性及對機體安全性的影響。
　　方法：根據(jù)細菌內同源重組的方法將hSERCA2a基因克隆到腺相關病毒載體中，與其包裝質粒pAAV pHelper發(fā)生重組，通過脂質體共轉染人胚腎293（HEK293）細胞，酶切鑒定和DNA測序鑒定正確后進行擴增、純化和滴度測定。110只

2、雄性SD大鼠隨機分為尾靜脈注射（Tail vein injection，TVI）組、心肌注射（Intramyocardial injection，IMI）組、心包腔注射（Intrapericardial injection，IPI）組，三組采用相應方法在體分別轉染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP、NS各200μL，其中，TVI組根據(jù)轉染病毒滴度不同又分為NS組、低劑量組（1×109 vg

3、/mL）、高劑量組（1×1011 vg/mL），各組分別轉染相應滴度AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP200μL。轉染28d熒光顯微鏡下觀察心肝腎組織綠色熒光表達情況，Western Blot技術檢測SERCA2a基因在大鼠各組織的相對表達量，體表12導聯(lián)心電圖檢測心律失常發(fā)生率，HE染色觀察病理學變化，心臟彩色多普勒超聲評價心功能，血液生化學指標檢測肝腎功能。
　　結果：
　　1）酶切鑒定和DNA測序鑒

4、定證明rAAV9-hSERCA2a-EGFP構建成功，滴度高達1×1012 vg/ml。
　　2）三組左心室可見大量綠色熒光表達，IM I組熒光局限在注射點，三組肝腎組織均可見微弱熒光；三組心肌SERCA2a蛋白相對表達量顯著高于肝腎（P<0.01），TVI組和IMI組心肌SERCA2a蛋白相對表達量明顯高于IPI組（P<0.01）；TVI組和IPI組心電圖正常，IMI組2只大鼠發(fā)生室性早搏；三組轉染AAV9-EGFP、AAV9-

5、SERCA2a-EGFP與轉染NS相比，心功能、組織病理學、血液生化學指標均無顯著差異（P>0.05）。
　　3）TVI法高劑量組心肌綠色熒光明顯高于低劑量組，高劑量組心肌SERCA2a蛋白相對表達量顯著高于低劑量組（P<0.05）；低、高劑量組轉染AAV9-EGFP、AAV9-SERCA2a-EGFP與NS對照組相比，心律失常發(fā)生率、心功能、組織病理學、血液生化學指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：