吸附于亞洲沙塵顆粒物上的焦油和脂多糖對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥作用的研究.pdf

1、亞洲沙塵顆粒物(Asian sand dust，ASD)常見(jiàn)于春季。當(dāng)我國(guó)北方和蒙古國(guó)發(fā)生沙塵暴時(shí)，產(chǎn)生的ASD能夠擴(kuò)散到大片地區(qū)，包括我國(guó)東部，朝鮮半島和日本，甚至?xí)竭^(guò)北太平洋到達(dá)美國(guó)。近年來(lái)，ASD由于對(duì)人群健康的不良影響而受到日益廣泛的關(guān)注。有些報(bào)道還提示ASD事件與成人和兒童患者呼吸系統(tǒng)癥狀增加有關(guān)。
　　我們以前的研究表明ASD可以加劇卵蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥，而將ASD在360℃

2、加熱使有毒物質(zhì)滅活后得到的經(jīng)加熱的ASD(heat-ASD，H-ASD)僅能導(dǎo)致輕微效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，我們推測(cè)，吸附于ASD的有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)可能在加劇肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥中起著一定作用。在ASD的長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，微生物和大氣污染物，包括焦油(Tar)、硫酸鹽和硝酸鹽會(huì)吸附于其上。因此，為了探究ASD中的Tar和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）污染是否與ASD加劇肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥明顯相關(guān)，我們進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)，觀察了

3、Tar和/或H-ASD對(duì)OVA誘導(dǎo)的肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥的加劇作用;LPS和/或H-ASD對(duì)OVA誘導(dǎo)的肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥的加劇作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、樣品處理
　　將從蒙古國(guó)南部沙漠采集的ASD樣品在電子加熱器中經(jīng)過(guò)360℃加熱處理30min，以除去吸附于顆粒物表面的微生物、硫酸鹽和硝酸鹽等成分，得到H-ASD。
　　將從日本北九州市采集的ASD用有機(jī)溶劑提取其中的Tar。
　　2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及染

4、毒
　　從Charles River公司（神奈川，日本）購(gòu)入雄性ICR和BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。每間隔一周，將小鼠在4％三氟氯溴乙烷作用下麻醉，經(jīng)氣管注入不同劑量的Tar或LPS、H-ASD(0.1 mg/mouse)和/或OVA。最后一次染毒的第二天，經(jīng)小鼠腹腔注射戊巴比妥，將其深度麻醉，放血處死。
　　3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理檢測(cè)
　　取小鼠肺部固定于10％中性福爾馬林緩沖液中，肺葉分離后，將其切割成

5、2mm大小的碎塊，用石蠟包埋，制作成3μm厚的切片。HE染色后觀察呼吸道由近端向遠(yuǎn)端嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。PAS染色后觀察支氣管上皮杯狀細(xì)胞的增殖情況。
　　4、采集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)和血液
　　小鼠深度麻醉，心臟采血，離心分離血漿，-80℃深凍冰箱中保存，用于檢測(cè)血漿中的OVA特異性抗體IgE和IgG1的表達(dá);氣管固定，用37℃無(wú)菌生理鹽水灌洗

6、小鼠肺部，收集灌洗液后離心取上清液，-80℃深凍冰箱中保存，用于檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子和趨化因子的蛋白表達(dá)。
　　5、BALF中的炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　將BALF離心后得到的沉淀溶于生理鹽水中，制成細(xì)胞懸液，顯微鏡下應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞懸液應(yīng)用細(xì)胞離心涂片機(jī)制作細(xì)胞涂片，應(yīng)用Diff-Quik染色，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞。
　　6、BALF中的細(xì)胞因子和趨化因子的檢測(cè)
　　應(yīng)用酶聯(lián)免

7、疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子和趨化因子的蛋白表達(dá)。其中細(xì)胞因子包括:白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-17A和干擾素(interferon，IFN)-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforminggr

8、owth factor, TGF)-β;趨化因子包括:角質(zhì)細(xì)胞趨化因子(Keratinocytechemoattractant，KC)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、MCP-3、調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子(regulated on activation normal T

9、cellexpressed and presumably secreted，RANTES)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)。
　　7、OVA特異性免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)E和IgG1抗體的檢測(cè)
　　用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血漿中OVA特異性IgE和IgG1抗體的表達(dá)。
　　8、分離培養(yǎng)基因敲除小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(bone-marrowderived macrophages, BMD

10、Ms)
　　分離培養(yǎng)來(lái)源于野生型(wildtype，WT)、Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)2基因敲除、TLR4基因敲除、髓樣分化因子(myeloid differentiation factor88，MyD88)基因敲除小鼠的BMDMs，以PBS或LPS孵育12h，用Elisa法檢測(cè)上清液中的IL-6、MCP-1、MIP-1α和TNF-α等細(xì)胞因子和趨化因子。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　

11、本研究應(yīng)用SPSS Statistics Client21統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表述為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用單因素方差分析比較不同染毒組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);當(dāng)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用Tukey法進(jìn)行組間比較，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、OVA、H-ASD和Tar或LPS干預(yù)對(duì)小鼠BALF中細(xì)胞分布的影響
　　OVA單獨(dú)作用沒(méi)有增加這幾種細(xì)胞中任何一種的數(shù)量，但是當(dāng)它與Tar或LPS聯(lián)合作用時(shí)

12、，這幾種細(xì)胞的數(shù)量都有輕度增加。而且當(dāng)H-ASD+Tar或H-ASD+LPS與OVA聯(lián)合作用時(shí)，這幾種細(xì)胞的數(shù)量都明顯增加了。
　　2、OVA、H-ASD和Tar或LPS干預(yù)對(duì)小鼠氣道病理改變的影響
　　H-ASD+OVA+Tar和H-ASD+OVA+LPS導(dǎo)致了小鼠氣道上皮中杯狀細(xì)胞中度增殖，伴有氣道粘膜下嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中至重度浸潤(rùn)。
　　3、OVA、H-ASD和Tar或LPS干預(yù)對(duì)小鼠BALF中

13、細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)的影響
　　與Control、OVA和單獨(dú)干預(yù)組相比，H-ASD+ OVA+ Tar和H-ASD+ OVA+LPS升高了BALF中IL-5、IL-13、eotaxin和MCP-3的水平。
　　4、OVA、H-ASD和Tar或LPS干預(yù)對(duì)小鼠OVA-IgE和OVA-IgG1生成的影響
　　與Control、OVA和單獨(dú)干預(yù)組相比，H-ASD+ OVA+ Tar和H-ASD+OVA+LPS促進(jìn)了OVA

14、-IgG1的生成;H-ASD+OVA+ LPS1還促進(jìn)了OVA-IgE的生成。
　　5、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)
　　LPS刺激TLR4基因敲除小鼠BMDMs，未能誘導(dǎo)TNF-α和IL-6的表達(dá)，但是LPS刺激TLR2基因敲除小鼠BMDMs，能誘導(dǎo)TNF-α和IL-6的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　本研究的結(jié)果證明，在OVA和H-ASD存在的條件下，ASD上所附著的Tar或LPS可加劇過(guò)敏性肺炎。而且L