Ⅰ型單純皰疹病毒感染內(nèi)耳神經(jīng)元的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分Ⅰ型單純皰疹病毒感染螺旋神經(jīng)元的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:建立Ⅰ型單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus-1，HSV-1）在體外螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系中的裂解性感染(lytic infection)模型及潛伏感染(latentinfection)再激活(Viral reactivation)模型。
　　方法:出生4-6天的Sprague-Dawley大鼠，解剖出蝸軸，進(jìn)行消化分離后種植于96孔板內(nèi)。一部分神

2、經(jīng)元培養(yǎng)4天后直接加入表達(dá)內(nèi)源性綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的低滴度HSV-1，形成裂解性感染，相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化和GFP表達(dá)情況;另一部分培養(yǎng)的神經(jīng)元在第二天加入含有阿昔洛韋(Acyclovir, ACV)的培養(yǎng)液，第4天加入HSV-1后并繼續(xù)培養(yǎng)于含有ACV的培養(yǎng)液中，形成潛伏感染，第8天撤去ACV，將培養(yǎng)液換成含有曲古抑菌素(Trichostatin

3、A，TSA)的培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下每日觀察GFP表達(dá)情況，計(jì)數(shù)呈GFP陽性的96孔板的孔數(shù)。搜集裂解性感染模型及潛伏感染模型的細(xì)胞上清液及細(xì)胞，TCID50方法檢測(cè)病毒滴度;并采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)不同感染狀態(tài)的特異性標(biāo)志物ICP27、LAT的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:HSV-1直接加入螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系后可以形成裂解性感染，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、壞死，從瓶壁脫落，熒光顯微鏡下可見大量GFP的形成，TCID50方法可以檢

4、測(cè)到培養(yǎng)液內(nèi)高滴度的具有感染性的子代病毒，RT-PCR能檢測(cè)到裂解性感染的轉(zhuǎn)錄物ICP27和潛伏感染的特異性轉(zhuǎn)錄物L(fēng)AT;培養(yǎng)液中加入ACV后病毒能在神經(jīng)元內(nèi)形成潛伏感染，此時(shí)熒光顯微鏡下觀察不到GFP，TCID50也檢測(cè)不到子代病毒的形成，RT-PCR只能檢測(cè)潛伏感染的特異性標(biāo)志物L(fēng)AT;加入激活劑TSA后潛伏感染的病毒可以被再激活，表現(xiàn)為熒光顯微鏡下再次出現(xiàn)GFP，培養(yǎng)體系內(nèi)細(xì)胞發(fā)生病變效應(yīng)，TCID50能檢測(cè)到子代病毒的形成。

5、r>　　結(jié)論:HSV-1能在體外螺旋神經(jīng)元培訓(xùn)體系內(nèi)形成裂解性感染和潛伏感染兩種感染狀態(tài)，潛伏感染在激活劑的作用下能轉(zhuǎn)化成裂解性感染。
　　第二部分非甾體消炎藥對(duì)Ⅰ型單純皰疹病毒感染體外培養(yǎng)前庭神經(jīng)元的影響
　　目的:建立HSV-1在體外前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中的裂解性感染及潛伏感染再激活模型，觀察非甾體消炎藥(Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)吲哚美辛及西樂葆對(duì)HSV-1

6、裂解性感染及潛伏感染再激活的影響
　　方法:出生4-6天的Sprague-Dawley大鼠，解剖出前庭神經(jīng)節(jié)，進(jìn)行消化分離后種植于96孔板內(nèi)。首先向前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中加入病毒后，在不同時(shí)間點(diǎn)用實(shí)時(shí)定量PCR方法和Western blot方法檢測(cè)培養(yǎng)體系中環(huán)氧化酶(Cycloxygenase，COX)基因轉(zhuǎn)錄物和蛋白的表達(dá)情況;接著向一部分前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中直接加入低滴度HSV-1和不同濃度梯度的吲哚美辛、西樂葆或前列腺素E2(

7、PGE2)，不同時(shí)間點(diǎn)搜集病毒和細(xì)胞懸液，TCID50檢測(cè)病毒滴度，與不加藥物組的病毒滴度進(jìn)行比較;向另一部分前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系內(nèi)添加ACV使HSV-1形成潛伏感染后，用TSA激活的同時(shí)加入吲哚美辛，熒光顯微鏡下每日觀察GFP表達(dá)情況，計(jì)數(shù)呈GFP陽性的96孔板的孔數(shù)，計(jì)算激活率，比較加與不加吲哚美辛情況下GFP出現(xiàn)的陽性孔率的區(qū)別，并用TCID50方法檢測(cè)兩種狀態(tài)時(shí)病毒滴度的差異。同時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)不同感染狀態(tài)下的特異性標(biāo)志物I

8、CP27、LAT的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:COX-1主要表達(dá)于前庭神經(jīng)元的胞核，COX-2主要表達(dá)于胞漿內(nèi);向前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中加入病毒后，能誘導(dǎo)COX的表達(dá)，加入HSV-1后8小時(shí)，COX-2基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)達(dá)到高峰，是對(duì)照組的14倍，而COX-1表達(dá)水平無明顯變化;吲哚美辛和西樂葆能抑制前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系內(nèi)HSV-1的復(fù)制，但這種抑制作用呈濃度依賴性，100μmol/L的吲哚美辛作用48小時(shí)可以使病毒滴度降低10倍，而15μm