α-細辛醚開啟斑馬魚血腦屏障作用機制及其生物安全性的研究.pdf

1、本文主要研究α-細辛醚對斑馬魚血腦屏障(Blood brain barrier, BBB)結(jié)構(gòu)及緊密連接蛋白家族Claudin、occludin、ZO、JAM基因表達的影響，以闡明α-細辛醚開啟血腦屏障的作用機制，并對α-細辛醚的生物安全性進行評價，主要對斑馬魚的生殖毒性和胚胎發(fā)育毒性進行研究，為人畜臨床應(yīng)用α-細辛醚奠定理論基礎(chǔ)。
　　采用的方法主要利用心臟注射方式將大分子熒光物質(zhì)Dextran Texas Red注入斑馬魚幼魚

2、心臟，之后將其浸泡在α-細辛醚溶液中，利用共聚焦顯微鏡觀察α-細辛醚是否能幫助大分子熒光物質(zhì)通過血腦屏障進入腦內(nèi);成年斑馬魚通過腹腔注射方式給予α-細辛醚后，利用透射電鏡觀察α-細辛醚作用斑馬魚成魚后，斑馬魚血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化;利用腦組織切片HE染色，顯微鏡觀察斑馬魚腦組織結(jié)構(gòu)的影響;利用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative, RT-qPCR）來研究α-細辛醚對斑馬魚緊密連接蛋白家族Claudin、ZO、

3、occludin、JAM基因表達及時效性的影響;α-細辛醚的生物安全性胚胎發(fā)育毒性，取受精后3h(Hourspost-ferilization，hpf)的斑馬魚胚胎放入不同濃度梯度的α-細辛醚溶液中暴露，分別觀察暴露在α-細辛醚在24hpf，48hpf，72hpf，96hpf不同時間點胚胎發(fā)育的形態(tài)現(xiàn)象，統(tǒng)計斑馬魚胚胎自主抽動的頻率、孵化率、心率、畸形率及死亡率等指標的變化，包括心包的水腫、脊柱的彎曲、尾巴的彎曲、卵黃囊水腫等現(xiàn)象:利用

4、RT-qPCR方法來檢測斑馬魚浸泡α-細辛醚96hpf后對sepn1基因表達的影響。利用斑馬魚行為學系統(tǒng)Noldus來評價α細辛醚對斑馬魚幼魚運動方式及運動能力的影響。
　　由試驗得到的結(jié)果如下:斑馬魚心臟注射大分子熒光染料后，浸泡在養(yǎng)殖水和α-細辛醚中，發(fā)現(xiàn)浸泡α-細辛醚30min后斑馬魚的血管有些模糊，周圍已經(jīng)有少量的熒光物質(zhì)滲出，浸泡α-細辛醚60min后可觀察到斑馬魚血管更加的模糊，說明已經(jīng)有大量的熒光物質(zhì)從血管內(nèi)滲出，而

5、對照組卻沒有看到熒光物質(zhì)滲出。通過電鏡觀察的結(jié)果顯示，給予α-細辛醚后，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)輕度的皺縮，BBB的基膜出現(xiàn)膨大斷裂，緊密連接出現(xiàn)疏松。而對照組的內(nèi)皮細胞未出現(xiàn)皺縮，比較飽滿，緊密連接致密，基膜結(jié)構(gòu)完整連續(xù)。利用HE組織切片來觀察斑馬魚腦組織結(jié)構(gòu)的結(jié)果與BBB超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果相一致。腹腔注射α-細辛醚作用1h后，大部分的Claudin家族基因如Claudin-19、-k、-j、-5a、-7a、-7b、-a、-h、-11a下調(diào)。其中Cl

6、audin-5b、-11b上調(diào)。Claudin-2上下調(diào)沒有太明顯的變化。其他家族的基因如JAM，-2A、-2B、-3A、-3B、occludin-A、occludin-B均下調(diào)，下調(diào)的幅度卻是不盡相同。腹腔注射α-細辛醚后，Claudin5a在1h下調(diào)最明顯，作用2h又逐漸的恢復(fù)，到8h基本恢復(fù)正常水平。將斑馬魚胚胎暴露在不同濃度的α-細辛醚溶液中，24hpf斑馬魚自主抽動的次數(shù)降低;48hpf斑馬魚的心率減低;72hpf斑馬魚幼魚有

7、脊柱彎曲、心包水腫、尾巴彎曲、卵黃囊水腫等畸形的表征;96hpf斑馬魚幼魚的孵化率、死亡率有很大的差異;通過斑馬魚幼魚運動行為學表明隨著α-細辛醚濃度增加，斑馬魚幼魚運動受到抑制。
　　本文的結(jié)論為芳香開竅藥能使緊密連接蛋白claudin家族基因表達下調(diào)，致使緊密連接結(jié)構(gòu)疏松，加之基膜結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)皮細胞皺縮，使得血腦屏障的屏障作用減弱，從而開啟了血腦屏障，發(fā)揮了開竅的作用。基因可逆性的下調(diào)說明α-細辛醚對血腦屏障是生理性的，對腦部