P190蛋白在維系血腦屏障結構中的作用及其機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的屏障之一，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)獨特內環(huán)境穩(wěn)定的重要結構。血腦屏障由腦內皮細胞與周細胞、星型膠質細胞及小膠質細胞等組成，能夠維持腦內離子、激素和遞質等的動態(tài)平衡，對一些能透過周圍血管的物質具有屏障作用從而保護腦組織，對維持腦組織內環(huán)境的穩(wěn)定性起著重要作用。其中，腦微血管內皮細胞間緊密連接和粘附連接是維持血腦屏障功能的核心結構，血管內皮細胞

2、間緊密連接的完整性對維持內皮細胞極性及調節(jié)內皮細胞通透性發(fā)揮著重要的作用。血腦屏障功能的變化和緊密連接的開放與閉合有關，而緊密連接開放與否與相關蛋白表達關系密切。
　　P190蛋白是一種神經(jīng)元跨膜蛋白，由1384個氨基酸組成，屬于單次跨膜蛋白，其N端在胞外，C端位于胞內。最初發(fā)現(xiàn)于有髓神經(jīng)纖維郎飛氏節(jié)的節(jié)旁區(qū)軸突細胞膜上，主要在脊椎動物腦內表達，另外在卵巢、胰臟、腸、肺、心臟及睪丸等組織內也有少量表達。目前研究表明，軸突細胞膜上的

3、P190、contactin與少突膠質細胞膜上的蛋白neurofascin155(NF155)在節(jié)旁區(qū)相互結合，形成間隔樣連接，從而將郎飛氏節(jié)區(qū)的離子環(huán)境與髓鞘內軸突周圍的離子環(huán)境分隔開來，保證神經(jīng)沖動的跳躍式傳導。P190蛋白表達異?？僧a生嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，P190-/-型小鼠的神經(jīng)沖動傳導速度明顯低于正常小鼠，而且在出生后不久即因神經(jīng)元變性壞死而導致死亡。另外有研究顯示多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)

4、患者腦內P190表達水平明顯降低。P190表達降低可進一步導致髓鞘脫離軸突，促進軸突變性壞死，進而形成神經(jīng)元變性損傷的惡性循環(huán)。在糖尿病性神經(jīng)病變的大鼠中，P190的表達水平也明顯降低。由此可見，P190蛋白的功能是至關重要的，但其具體功能和作用機制還不清楚。
　　我室研究人員發(fā)現(xiàn)P190蛋白除了在神經(jīng)軸突有表達外，在人腦微血管內皮細胞(HBMEC)內也有大量表達，而且表達的P190蛋白在細胞間連接處有聚集的傾向。基于此，本研究以

5、P190蛋白胞內段缺失突變細胞株作為基礎，進一步檢測P190胞內段缺失突變對HBMEC功能的影響;同時利用酵母雙雜交的方法，篩選與P190蛋白的胞內段互作的蛋白，期望找出P190對內皮細胞功能作用的機制。
　　方法：
　　一、P190在腦微血管內皮細胞中的表達及其與內皮細胞單層通透性的關系
　　1、激光共聚焦觀察P190在小鼠不同組織血管內皮細胞中的分布。
　　2、Western blot和激光共聚焦檢測P190

6、在體外分離腦血管中的表達和分布。
　　3、利用HRP通透性試驗，檢測P190不同結構域缺失突變對HBMEC細胞單層通透性的影響。
　　4、懸滴聚集試驗檢測P190不同結構域缺失突變及P190胞外段抗體封閉后對HBMEC的細胞間黏附力的影響。
　　5、利用western blot方法檢測P190胞內段缺失突變對HBMEC的緊密連接相關蛋白和粘附連接蛋白的表達的影響。
　　6、利用細胞免疫熒光方法檢測P190胞內段缺

7、失突變對HBMEC的緊密連接相關蛋白和粘附連接蛋白分布的影響。
　　二、P190胞內段結構域互作蛋白的篩選和鑒定
　　1、利用酵母雙雜交實驗篩選人胎腦文庫中與P190胞內段互作的蛋白，并在酵母中共轉進行驗證。
　　2、構建PLCD3全長及不同截短和P190胞內段的重組表達質粒。
　　3、共轉PLCD3全長及不同截短和P190胞內段的重組表達質粒至293T細胞中，應用免疫共沉淀的方法驗證P190胞內段與PLCD3相

8、互作用，并尋找PLCD3中與P190相互作用的結構域。
　　4、在HBMEC中驗證P190與PLCD3相互作用。
　　(1)純化GST-P190胞內段融合蛋白，利用GST pull-down實驗驗證P190胞內段與PLCD3相互作用。
　　(2)利用免疫共沉淀方法驗證P190與PLCD3相互作用。
　　5、Western blot和細胞免疫熒光檢測PLCD3在HBMEC中的表達和分布
　　6、構建干擾HBM

9、EC中PLCD3表達的shRNA，獲得穩(wěn)定干擾PLCD3的細胞株。
　　7、利用HRP通透性試驗，檢測PLCD3 knock down對HBMEC細胞單層通透性的影響。
　　8、利用western blot方法檢測PLCD3 knock down對HBMEC的緊密連接相關蛋白和粘附連接相關蛋白的表達的影響。
　　三、P190與PLCD3相互作用引起HBMEC通透性改變的機制研究
　　1、利用[3H]-inosit

10、ol標記細胞檢測培養(yǎng)的P190胞內段缺失細胞中PLC活化情況。
　　2、構建PLCD3不同活性的重組表達質粒。
　　3、免疫熒光觀察P190胞內段缺失細胞和PLCD3 knock down的細胞中F-actin的變化情況。
　　結果：
　　一、P190在腦微血管內皮細胞中的表達及其與內皮細胞單層通透性的關系
　　1、激光共聚焦結果顯示P190在小鼠腦微血管內皮細胞中特異性表達。
　　2、Western

11、 blot和激光共聚焦結果顯示P190在體外分離的小鼠腦微血管內皮細胞中表達。
　　3、成功獲得P190胞內段不同結構域缺失的細胞株。
　　4、HRP通透性實驗表明，P190胞內段缺失內皮細胞對HRP的通透性明顯高于對照組細胞，且有統(tǒng)計學意義;而SH3或band4.1結構域分別缺失的內皮細胞與對照組細胞相比，通透性則無明顯變化。
　　5、P190胞內段缺失突變破壞細胞連接相關蛋白
　　(1) Western bl

12、ot結果顯示P190胞內段缺失不影響粘附連接相關蛋白VE-cadherin的表達，但免疫熒光結果顯示P190胞內段缺失破壞了VE-cadherin在細胞連接處的分布。
　　(2)懸滴聚集實驗表明，P190胞內端缺失突變內皮細胞間粘附力明顯降低，而用P190胞外段抗體封閉后內皮細胞間粘附力無明顯改變。
　　(3)Western blot結果顯示，細胞緊密連接相關蛋白ZO-1、claudin5和claudin3表達水平無明顯改變

13、，而occludin表達則明顯下降。利用免疫熒光技術觀察到ZO-1和occludin在P190胞內段缺失細胞連接處分布發(fā)生改變。
　　二、P190胞內段結構域互作蛋白的篩選和鑒定
　　1、酵母雙雜交法篩選得到75個陽性克隆，經(jīng)DNA測序和NCBI BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)了九種序列。根據(jù)文獻資料選擇PLCD3進行后續(xù)驗證。
　　2、在酵母中驗證P190胞內段與PLCD3相互作用。
　　3、成功構建PLCD3全長及

14、不同截短和P190胞內段的重組表達質粒。
　　4、共轉PLCD3全長及不同截短和P190胞內段的重組表達質粒至293T細胞中，應用免疫共沉淀的方法驗證P190胞內段與PLCD3相互作用。結果顯示P190胞內段可以與PLCD3相互作用，且與PLCD3-C2結構域相互作用。
　　5、在HBMEC中驗證P190與PLCD3相互作用。
　　(1)成功純化GST-P190胞內段融合蛋白，利用GST pull-down實驗驗證P1

15、90胞內段與PLCD3相互作用。結果顯示P190胞內段可以與PLCD3相互作用。
　　(2)免疫共沉淀結果提示在HBMEC細胞中P190能與PLCD3相互作用
　　6、Western blot檢測PLCD3在HBMEC中的表達，免疫熒光結果顯示PLCD3主要分布在HBMEC細胞膜和細胞核中。
　　7、構建干擾HBMEC中PLCD3表達的shRNA，獲得穩(wěn)定干擾PLCD3的細胞株。
　　8、HRP通透性試驗結果顯示

16、PLCD3 knock down后HBMEC細胞單層通透性較對照組相比明顯升高。
　　9、Western blot結果提示PLCD3 knock down后HBMEC的緊密連接相關蛋白和粘附連接蛋白的表達無明顯改變。
　　三、P190與PLCD3互作引起HBMEC通透性改變的機制研究
　　1、PLC活性檢測結果發(fā)現(xiàn)P190胞內段缺失細胞株中PLC活性下降。
　　2、成功構建PLCD3不同活性的重組表達質粒。

17、>　　3、免疫熒光結果顯示在P190胞內段缺失和PLCD3 knock down的細胞中F-actin重組，stress fiber形成減少。
　　結論：
　　HBMEC細胞中P190胞內段(1305-1384aa)缺失后，可使內皮細胞單層的通透性明顯提高，內皮細胞間粘附力下降，F(xiàn)-actin發(fā)生重組，stress fiber形成減少，緊密連接相關蛋白和粘附連接相關蛋白的表達和發(fā)布發(fā)生改變，進而破壞血腦屏障的完整性。利用酵母

18、雙雜交系統(tǒng)篩選出P190胞內段的相互作用的新蛋白——PLCD3。通過免疫共沉淀和GST-pull down實驗證實P190胞內段可以與PLCD3相互作用，且與PLCD3-C2結構相互作用。同時干擾PLCD3在HBMEC中的表達可使內皮細胞單層通透性升高，F(xiàn)-actin發(fā)生重組，stress fiber形成減少，與P190胞內段缺失突變引起的現(xiàn)象一致。并且P190胞內段缺失突變細胞株中PLC活性下降，推測P190通過與PLCD3相互作用影