鹽酸戊乙奎醚對新生大鼠內(nèi)毒素血癥時腸組織HIF-1α表達的影響.pdf

1、新生兒腸損傷是兒科常見的疾病之一，其發(fā)生的主要原因有早產(chǎn)、窒息引起的缺血缺氧以及感染等。其中嚴(yán)重感染?？蓪?dǎo)致危重患兒胃腸功能衰竭。腸道在全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著極其重要的角色。腸道感染或缺血缺氧會導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，引起細菌及內(nèi)毒素的移位，引發(fā)敗血癥和膿毒性休克，從而進一步加重腸組織的損傷，甚者可伴隨遠隔器官受累。脂多糖(LPS)作為典型的內(nèi)毒素，可誘發(fā)內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致腸

2、黏膜損害。國內(nèi)外諸多研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在內(nèi)毒素性腸損傷的病理改變過程中具有重要作用。有研究指出腸道缺血缺氧可以誘導(dǎo)腸黏膜HIF-1α持續(xù)高表達，這一結(jié)果至少在部分程度上是由于腸道細菌的移位及其產(chǎn)物（如LPS）的增加所造成的。HIF-1α能夠通過激活其下游的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄并促進炎癥因子的大量釋放和引起細胞凋亡等，從而加重內(nèi)毒素血癥或缺血/再灌注時的組織損傷。鹽酸戊乙奎醚(PHC)是我國自主研制的抗膽堿藥。研究表明，鹽

3、酸戊乙奎醚因能改善微循環(huán)、降低毛細血管壁通透性和減少溶酶體釋放而具有多器官保護作用。目前鹽酸戊乙奎醚對內(nèi)毒素性肺損傷的保護作用得到了廣泛地證實和認可，我們通過大量的臨床觀察發(fā)現(xiàn)鹽酸戊乙奎醚在解除腸痙攣、減輕腸道水腫方面同樣具有良好的效果?；谝陨媳尘?，本課題旨在研究內(nèi)毒素致新生大鼠腸損傷時鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥對腸組織HIF-1α表達的影響，并對其腸保護作用機制進行初步探討。
　　目的:
　　探討鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥對內(nèi)毒素致

4、新生大鼠腸損傷時腸組織HIF-1α和其他相關(guān)細胞因子表達的影響及其發(fā)揮腸保護作用的可能機制，為臨床防治新生兒腸損傷提供一條新的思路。
　　材料與方法:
　　1.研究對象
　　69只SPF級健康新生7日齡SD大鼠，由鄭州大學(xué)河南省實驗動物中心提供，雌雄不限，體重18±2g。
　　2.實驗方法
　　2.1、實驗動物分組
　　本實驗分為兩部分。第一部分:將30只幼鼠隨機分為3組，每組10只。分別為生理鹽水對

5、照組（C組）、內(nèi)毒素致腸損傷模型組（L組）和鹽酸戊乙奎醚干預(yù)組（P組）。本部分實驗主要進行腸組織濕/干重比的測定、腸組織HE染色后光鏡下形態(tài)學(xué)改變的觀察以及相關(guān)細胞因子的檢測。第二部分:同樣將另39只健康新生7日齡SD大鼠隨機分為C組、L組和P組，每組13只。本部分實驗用于觀察造模后各組幼鼠行為活動的改變并計算每組24h生存率。
　　2.2、動物模型的制備
　　內(nèi)毒素致腸損傷模型組腹腔注射內(nèi)毒素（細菌脂多糖LPS，E.Col

6、i055:B5，Sigma公司，美國）5mg/kg，配制濃度為0.5mg/ml;鹽酸戊乙奎醚干預(yù)組在注射內(nèi)毒素前30min，先腹腔注射鹽酸戊乙奎醚（成都力思特制藥股份有限公司，批號:120603）2mg/kg，配制濃度為0.05mg/ml;生理鹽水對照組腹腔注射生理鹽水10ml/kg。第一部分實驗于腹腔注射內(nèi)毒素或生理鹽水后6h麻醉并解剖幼鼠。兩部分實驗均在造模完成后將幼鼠放回鼠籠與母鼠共同喂養(yǎng)。
　　2.3、腸組織的標(biāo)本采集

7、r>　　在密閉玻璃容器中吸入七氟烷快速麻醉幼鼠后，將其固定于操作臺，解剖，用1ml注射器迅速進行心臟采血，靜置2小時，4℃下4000r/min離心15分鐘，取上清液，-20℃冰箱中保存待檢。距回盲部3cm向上取回腸組織7cm，4℃生理鹽水沖洗腸管3遍，濾紙吸干腸組織表面水分后，將7cm回腸組織分為4段:上段1cm用于光鏡下形態(tài)學(xué)觀察，中上段2cm用于測量腸組織濕重和干重，中下段2cm用于制備腸組織勻漿測定相關(guān)細胞因子的表達，下段2cm用

8、于RT-PCR檢測腸組織HIF-1αmRNA的表達。
　　2.4、檢測指標(biāo)
　　2.4.1、計算腸組織濕/干重比(W/D)
　　電子稱重計稱量中上段2cm回腸組織并記錄濕重，隨后放入70℃恒溫烘干箱烘干48h至重量不再發(fā)生變化，測量干重，計算濕/干重比。
　　2.4.2、腸組織形態(tài)學(xué)觀察
　　將上段1cm回腸組織放入4％多聚甲醛中保存待檢。石蠟包埋后制作5μm病理切片，行HE染色。400倍光鏡下觀察回腸組織

9、黏膜上皮細胞形態(tài)學(xué)的改變。
　　2.4.3、ELISA法測定腸組織中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln、二胺氧化酶(DAO)及血清DAO的含量
　　中下段2cm回腸組織稱重后制備組織勻漿，4℃下3000r/min離心15分鐘，取上清液，置于-20℃冰箱中保存待檢。TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln和DAO的檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒（R&D公司，美國）說明書進行。
　　2.4.4、RT-PCR法測定腸

10、組織HIF-1αmRNA的表達
　　將下段2cm回腸組織經(jīng)DEPC水沖凈后濾紙吸干，經(jīng)液氮迅速冷卻后放入凍存管中，置于-80℃冰箱保存待檢。經(jīng)腸組織總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄、DNA擴增和瓊脂糖凝膠電泳等步驟檢測幼鼠腸組織HIF-1αmRNA的表達情況。
　　3.統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異法(

11、LSD-t)，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，即P＜0.05時，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.肉眼觀察，腹腔注射LPS后，1小時內(nèi)L組與P組幼鼠開始出現(xiàn)渾身抖動，呼吸急促。2～3小時左右出現(xiàn)周身發(fā)涼，精神萎靡，活動度下降，并且進食減少。6小時左右出現(xiàn)明顯的倦怠乏力，幾乎不活動也不進食，甚者口唇青紫。P組幼鼠癥狀相對較輕，C組幼鼠活動、進食等情況正常。C組、L組及P組的24h生存率分別為100％、69.2％和92.3％

12、，幼鼠死亡主要發(fā)生在注射LPS后12～24小時期間。
　　2.與C組比較，L組和P組腸組織濕/干重比均顯著升高(P＜0.05);與L組比較，P組的這一比值顯著降低(P＜0.05)。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.HE染色光鏡結(jié)果顯示:C組回腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列整齊，形態(tài)正常;L組可見絨毛細胞水腫，上皮細胞排列紊亂;P組絨毛水腫較L組明顯減輕，上皮細胞排列較整齊。
　　4.與C組比較，L組和P組腸組織TNF-α、I

13、L-6、HIF-1α的含量均升高(P＜0.05)，而Gln的含量降低(P＜0.05);與L組比較，P組腸組織Gln的含量較高(P＜0.05)，而余各指標(biāo)的含量均較低(P＜0.05)。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.與C組比較，L組和P組腸組織DAO含量均顯著降低，而血清DAO含量升高(P＜0.05);與L組比較，P組腸組織DAO含量較高，而血清DAO含量較低(P＜0.05)。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6.與C組比較，L組和P組