四物湯對(duì)缺鐵性貧血幼鼠的體質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶能力改善作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究四物湯對(duì)缺鐵性貧血幼鼠的體質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶能力改善作用及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步將四物湯作為用于治療缺鐵性貧血的藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴四物湯水煎液主要成分含量的測(cè)定試驗(yàn)方法原子吸收法測(cè)定四物湯水煎液中的鐵含量。高效液相色譜建立四物湯中阿魏酸，毛蕊花糖苷和芍藥苷含量的測(cè)定方法。測(cè)定條件：色譜柱均為YMC-PACK ODS-A柱，流速均為1.0mL·min-1，柱溫均為30℃。阿魏酸含量測(cè)定的流動(dòng)相為乙腈:0.085％磷酸

2、溶液=17:83，檢測(cè)波長(zhǎng)為316nm。毛蕊花糖苷含量測(cè)定的流動(dòng)相為乙腈:0.1%醋酸溶液=16:84，檢測(cè)波長(zhǎng)為334nm。芍藥苷含量測(cè)定的流動(dòng)相為乙腈:0.1%磷酸溶液=14:86，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。⑵缺鐵性貧血幼鼠模型復(fù)制及分組給藥21d大鼠，雌雄各半，分為正常組10只和造模組50只，分別飼喂含鐵約45ppm的標(biāo)準(zhǔn)飼料或含鐵約3ppm的低鐵飼料，自由攝食飲水。2周后，各組大鼠內(nèi)眥靜脈采血測(cè)定血常規(guī)，以每只大鼠血紅蛋白含量和體重

3、均低于正常組大鼠均值判定為該大鼠造模成功。用隨機(jī)數(shù)表法將造模成功的大鼠分為模型組，琥珀酸亞鐵50mg·kg-1組，四物湯4g·kg-1組，8g·kg-1組和16g·kg-1組，每組10只。統(tǒng)計(jì)各造模組大鼠血紅蛋白含量和體重?zé)o顯著性差異后，灌胃給藥，每天1次，4周后結(jié)束給藥，進(jìn)行下列各項(xiàng)試驗(yàn)。3四物湯水煎液對(duì)缺鐵性貧血幼鼠體質(zhì)的改善作用試驗(yàn)方法各組大鼠內(nèi)眥靜脈采血測(cè)定血常規(guī)，制作血涂片。肝臟行冰凍切片制作HE染色。分析比較各指標(biāo)組間差異性

4、。⑶四物湯水煎液對(duì)缺鐵性貧血幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用試驗(yàn)方法。識(shí)別記憶能力測(cè)定：采用新舊物體替換法測(cè)試大鼠接觸物體所占時(shí)間，共3天，大鼠對(duì)新、舊物體的探究時(shí)間分別記為 Tn和 Tf。大鼠接觸新物體所占時(shí)間的比值=Tn/Tn+Tf。比值越大，表明大鼠的識(shí)別記憶能力越強(qiáng)。工作記憶能力測(cè)定：采用Morris水迷宮水下平臺(tái)象限法，測(cè)試大鼠找到平臺(tái)的平均時(shí)間，共4天。統(tǒng)計(jì)各組大鼠第1，2次找到平臺(tái)的平均時(shí)間差。平均時(shí)間差越大，表明大鼠的工作記憶

5、能力越強(qiáng)?？臻g記憶能力測(cè)定：第1~4天為定位航行試驗(yàn)。采用Morris水迷宮水下平臺(tái)象限法，測(cè)得大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期。逃避潛伏期越短，表明大鼠空間記憶獲取的能力越強(qiáng)。第5天為空間探索試驗(yàn)，撤去平臺(tái)，大鼠在平臺(tái)所在象限游泳的時(shí)間和距離越長(zhǎng)，表明大鼠空間記憶保持的能力越強(qiáng)。四物湯水煎液改善缺鐵性貧血幼鼠體質(zhì)和學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制試驗(yàn)方法取血分離血清測(cè)定血清鐵、總鐵結(jié)合力、血清鐵蛋白和血清鐵調(diào)素。肝組織勻漿測(cè)定肝臟鐵和肝臟鐵調(diào)素含量、

6、肝臟鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達(dá)。腦組織行冰凍切片制作HE染色。分離海馬區(qū)，采用免疫印跡法檢測(cè)突觸可塑性相關(guān)蛋白BDNF，TrkB，CamKⅡα和CREB-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：①試驗(yàn)用四物湯水煎液的3種主要成分含量和Fe含量本試驗(yàn)四物湯水煎液中阿魏酸含量為0.374 mg·g-1，毛蕊花糖苷含量為0.040 mg·g-1，芍藥苷含量為5.837 mg·g-1，F(xiàn)e含量為0.359 mg·g-1。②缺鐵性貧血幼鼠模型成功

7、率及用藥前組間均衡性檢驗(yàn)與正常組相比，50只造模大鼠血紅蛋白含量和體重每只均顯著低于正常組大鼠均值，造模成功率100%。將造模成功大鼠隨機(jī)分組后，各造模組大鼠血紅蛋白含量和體重均無(wú)顯著性差異（均P＞0.05）。③四物湯水煎液顯著改善缺鐵性貧血幼鼠的體質(zhì)與正常組相比，模型組大鼠活動(dòng)量減少，耳廓和腳趾呈蒼白色；體重和各血常規(guī)參數(shù)顯著降低（均P＜0.05）；紅細(xì)胞數(shù)量減少，體積變小，中央淡染區(qū)擴(kuò)大；肝臟呈淺紅色，中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞索分界不清

8、晰，排列雜亂。與模型組相比，四物湯組大鼠活動(dòng)量增多，耳廓和腳趾色澤紅潤(rùn)；體重和血常規(guī)各參數(shù)顯著升高（均P＜0.05）；紅細(xì)胞數(shù)量增多，體積變大，中央淡染區(qū)縮小；肝臟顏色變紅，中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞索分界較清晰，排列趨于整齊。④四物湯水煎液顯著改善缺鐵性貧血幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力①與正常組相比，模型組大鼠接觸新物體所占時(shí)間顯著縮短（P＜0.05）。與模型組相比，四物湯各組大鼠接觸新物體所占時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。表明四物湯可以顯著改善缺

9、鐵性貧血幼鼠的識(shí)別記憶。②與正常組相比，模型組大鼠第1，2次找到平臺(tái)的平均時(shí)間差顯著縮短（P＜0.01）。與模型組相比，四物湯16g·kg-1組大鼠第1，2次找到平臺(tái)的平均時(shí)間差顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。表明四物湯可以顯著改善缺鐵性貧血幼鼠的工作記憶。③定位航行試驗(yàn)中，與正常組相比，模型組大鼠第2天的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）。與模型組相比，四物湯8g·kg-1和16g·kg-1組大鼠第2天的逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。

10、表明四物湯可以顯著提高缺鐵性貧血幼鼠的空間記憶獲取能力。④空間探索試驗(yàn)中，與正常組相比，模型組大鼠在平臺(tái)所在象限游泳的時(shí)間和距離顯著縮短（P＜0.05）。與模型組相比，四物湯各組大鼠在平臺(tái)所在象限游泳的時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），四物湯8g·kg-1和16g·kg-1組大鼠在平臺(tái)所在象限游泳的距離顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。表明四物湯可以顯著提高缺鐵性貧血幼鼠的空間記憶保持能力。⑤四物湯水煎液改善缺鐵性貧血幼鼠體質(zhì)和學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制

11、①四物湯水煎液改善缺鐵性貧血幼鼠體質(zhì)的機(jī)制：與正常組相比，模型組大鼠血清鐵、血清鐵蛋白、肝臟鐵含量和肝臟鐵蛋白表達(dá)顯著降低（均P＜0.05）；總鐵結(jié)合力、血清鐵調(diào)素、肝臟鐵調(diào)素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達(dá)顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，四物湯組血清鐵、血清鐵蛋白、肝臟鐵含量和肝臟鐵蛋白表達(dá)顯著升高（均P＜0.05）；總鐵結(jié)合力、血清鐵調(diào)素、肝臟鐵調(diào)素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達(dá)顯著降低（均P＜0.05）。②四物湯水煎液改善

12、缺鐵性貧血幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制：與正常組相比，模型組大鼠海馬 CA1區(qū)的錐體細(xì)胞排列紊亂，海馬區(qū)BDNF、TrkB、CamKⅡα和CREB-1表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）。與模型組相比，四物湯各組大鼠海馬 CA1區(qū)的錐體細(xì)胞排列趨于整齊，海馬區(qū)BDNF、TrkB、CamKⅡα和CREB-1表達(dá)均顯著升高（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：⑴對(duì)所用四物湯水煎液進(jìn)行了質(zhì)量控制，其中阿魏酸含量為0.374 mg·g-1，毛蕊花糖苷含量為

13、0.040 mg·g-1，芍藥苷含量為5.837 mg·g-1，F(xiàn)e含量為0.359 m g·g-1。⑵四物湯可以顯著改善缺鐵性貧血幼鼠的體質(zhì)。其機(jī)制與升高血清鐵、血清鐵蛋白、肝臟鐵含量，促進(jìn)肝臟鐵蛋白表達(dá)，降低總鐵結(jié)合力、血清鐵調(diào)素含量，抑制肝臟鐵調(diào)素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達(dá)，調(diào)節(jié)鐵代謝有關(guān)。⑶四物湯可以顯著提高缺鐵性貧血幼鼠的識(shí)別記憶、工作記憶和空間記憶能力。其機(jī)制可能與上調(diào)海馬區(qū)BDNF及BDNF-TrkB-CREB通路蛋