重組腺病毒-胸苷激酶自殺基因前藥系統(tǒng)對鼻咽癌CNE-2細胞放射增敏作用的體外實驗研究.pdf

1、目的:本實驗利用進入Ⅱ期臨床試驗的重組腺病毒-胸苷激酶(Adenovirus-thymidine kinase,ADV-TK)轉染鼻咽癌CNE-2細胞進行體外實驗,觀察ADV-TK／GCV(Adenovirus-thymidine kinase／ganciclovir)自殺基因前藥系統(tǒng)對鼻咽癌CNE-2細胞的殺傷作用以及放射增敏作用。
　　 方法:分別用不同感染復數(shù)(Multiplicity ofInfection,MOI)的A

2、DV-TK轉染鼻咽癌CNE-2細胞,3h后更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)72h,倒置顯微鏡下觀察轉染前后細胞形態(tài)變化,WST-1檢測不同MOI轉染后細胞存活率。不同濃度GCV作用于鼻咽癌CNE-2細胞,繼續(xù)培養(yǎng)72h,倒置顯微鏡下觀察細胞存活情況,WST-1檢測不同濃度GCV作用下的細胞存活率。選取對鼻咽癌CNE-2細胞無明顯毒性作用的MOI為100作為下一步實驗研究,轉染鼻咽癌CNE-2細胞,3h后更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h,用不同濃度

3、GCV作用,繼續(xù)培養(yǎng)72h,倒置顯微鏡下觀察細胞存活情況,WST-1檢測細胞存活率,計算GCV的IC10、IC50。選取MOI為100及IC10進行放射增敏實驗,實驗分單純放療組、ADV-TK+放療組、GCV+放療組、ADV-TK／GCV+放療組:MOI為100的ADV-TK轉染細胞3h,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h,加入GCVIC10,繼續(xù)培養(yǎng)48h,四組分別給予0、0.5、1、2、3、4、6、8、10Gyγ射線照射,每個照射劑量組

4、設三個培養(yǎng)皿,照射后立即更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)14d后,觀察各不同處理組對CNE-2細胞的殺傷作用,計算克隆形成率、細胞存活分數(shù),用單擊多靶數(shù)學模型進行曲線擬合作圖,計算放射增敏比。
　　 結果:倒置顯微鏡下觀察ADV-TK基因轉染后的鼻咽癌CNE-2細胞體積較對照組增大,輪廓較模糊,邊界欠清,細胞內(nèi)出現(xiàn)較多粗大的黑色顆粒樣物質,主要集中于細胞核內(nèi),而未轉染ADV-TK基因的細胞內(nèi)無明顯顆粒狀物質出現(xiàn)。MOI100時存活率為9

5、8.21％,MOI為1000時存活率為85.97％,MOI≥1000時對鼻咽癌CNE-2細胞有明顯毒性作用。GCV濃度為100ug／ml及1000ug／ml時,細胞存活率分別為98.38％和84.63％,GCV濃度為≥1000ug／ml時對細胞具有明顯的抑制作用。選取MOI為100轉染鼻咽癌CNE-2細胞,不同濃度GCV作用于細胞,計算IC10和IC50分別為7.1968ug／ml和196.0358ug／ml,GCV對鼻咽癌CNE-2細

6、胞的殺傷作用具有濃度依賴性。放射增敏實驗,單純照射組:DO值為1.238 Gy,Dq值為2.838Gy,N值為3.284；ADV-TK+放射組:DO值為1.237Gy,Dq值為2.607 Gy,N值為3.108,放射增敏比SERDo為1.001,SERDq為1.089,SERSF2為1.036；GCV+放射組:DO值為1.232Gy,Dq值為2.800Gy,N值為3.274,放射增敏比SERDo為1.005,SERDq為1.014,SE

7、RSF2為1.005；ADV-TK／GCV+放射組:DO值為0.880Gy,Dq值為1.561Gy,N值為2.775,放射增敏比SERDo為1.407,SERDq為1.818,SERSF2為2.141。
　　 結論:(1)ADV-TK成功轉染CNE-2細胞。(2)ADV-TK(MOI)≥1000對CNE-2細胞具有明顯的毒性作用。(3)GCV≥1000ug／ml對鼻咽癌CNE-2細胞具有明顯抑制作用。(4)ADV-TK／GCV自