Ang2-siRNA質(zhì)粒殼聚糖磁性納米微粒靜脈給藥安全性毒理實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)靶向性實(shí)驗(yàn).pdf

1、目的：
　　擬用本實(shí)驗(yàn)前期制備的Ang2-siRNA質(zhì)粒殼聚糖磁性納米微粒，經(jīng)尾靜脈注射入小鼠及大鼠體內(nèi)，觀察該微粒的安全性及毒理性，建立惡性黑色素瘤裸鼠模型，觀察Ang2-siRNA質(zhì)粒殼聚糖磁性納米微粒的靶向性，為后期進(jìn)一步進(jìn)行裸鼠惡性黑色素移植瘤的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)靶向性干預(yù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，為惡性黑色素瘤的基因靶向治療提供新途徑和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒急

2、性毒性實(shí)驗(yàn)
　　急性毒性實(shí)驗(yàn)的考察選擇KM小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別經(jīng)尾靜脈一次性給予小鼠五種濃度（91.6mg/kg、152.8mg/kg、254.6mg/kg、424.2mg/kg、707.0mg/kg）的Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒，對(duì)照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)觀察14天內(nèi)小鼠的死亡、飲食及體重變化，大體標(biāo)本觀察臟器顏色、形態(tài)，并且對(duì)心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進(jìn)行病理組織檢查，HE染色和普魯士染色觀察臟器的

3、情況。
　　2、Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)研究
　　慢性毒性實(shí)驗(yàn)將SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將其分為四組，即低、中、高濃度劑量組（35.35mg/kg、70.70mg/kg、353.50mg/kg）及對(duì)照組，對(duì)照組予以注射生理鹽水，均予以尾靜脈注射微粒懸浮液1ml，連續(xù)注射14d，第15d停藥，繼續(xù)觀察7d，觀察給藥后大鼠的一般表現(xiàn)及體重變化情況，第21d處死小鼠，取眼球血進(jìn)行血常規(guī)及生化檢查，大

4、體標(biāo)本觀察臟器顏色、形態(tài)，對(duì)主要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，HE染色和普魯士染色觀察臟器的情況。
　　3、Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒體內(nèi)靶向性研究
　　構(gòu)建惡性黑色素瘤裸鼠移植瘤模型，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的惡性黑色素瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將其接種于裸鼠右腋皮下，待裸鼠皮下腫瘤長(zhǎng)至約6mm×6mm時(shí)，將荷瘤鼠隨機(jī)分成3組，分別為靶向組，非靶向組以及空白對(duì)照組。靶向組荷瘤裸鼠通過(guò)尾靜脈注射殼聚糖磁性納米微粒溶液0.4ml，

5、緊貼右腋皮下外加4000GS的磁場(chǎng)，60min后撤去磁場(chǎng)，同時(shí)立即處死裸鼠；非靶向組荷瘤裸鼠通過(guò)尾靜脈注射質(zhì)粒耦連微粒0.4ml，體外不加磁場(chǎng)，60min后立即處死裸鼠；空白對(duì)照組的荷瘤裸鼠通過(guò)尾靜脈注射等體積的生理鹽水，體外不加磁場(chǎng)，60min后立即處死裸鼠。處死后進(jìn)行腫瘤組織病理學(xué)檢查，HE染色及普魯士藍(lán)染色驗(yàn)證微粒在腫瘤組織中的分布。
　　結(jié)果：
　　1、Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒急性毒性實(shí)驗(yàn)

6、>　　空白組及各濃度組小鼠給藥后均未出現(xiàn)死亡，Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒的LD50>707.0mg/kg，遠(yuǎn)高于臨床所需量，對(duì)小鼠的飲食、體重?zé)o明顯影響，且主要臟器除了高濃度組引起部分肺淤血外，余未見明顯異常，表明其急性毒性相對(duì)較低。
　　2、Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)研究
　　Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒對(duì)大鼠的一般活動(dòng)表現(xiàn)、飲水、攝食、體重增長(zhǎng)以及肝腎

7、功能無(wú)明顯影響，經(jīng)大鼠主要臟器病理學(xué)組織檢查，中、高劑量組引起大鼠肺部慢性非肺淤血及纖維化，低劑量組大鼠主要臟器組織病理學(xué)未見明顯異常，可以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)的最低劑量35.35mg/(kg.d)×14d，對(duì)受試動(dòng)物基本無(wú)毒性，所以在一定的濃度范圍內(nèi)，該藥物長(zhǎng)期使用是安全的。
　　3、Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒體內(nèi)靶向性研究
　　空白對(duì)照組腫瘤組織普魯士藍(lán)染色陰性，非靶向組腫瘤組織普魯士藍(lán)染色呈弱陽(yáng)性，靶向組腫瘤

8、組織被膜及血管內(nèi)大量的顆粒聚集，普魯士藍(lán)染色強(qiáng)陽(yáng)性。由此可以推斷，Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒在外加磁場(chǎng)的作用下，能定向向腫瘤組織移動(dòng)，并且聚集在惡性黑色素移植瘤內(nèi)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。
　　結(jié)論：
　　Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒毒作用的靶器官主要是肺部，主要是引起肺部炎癥，急慢性肺淤血，肺部纖維化，但是該微粒對(duì)小鼠、大鼠的一般表現(xiàn)、攝食、飲水、體重及肝腎功能無(wú)明顯影響。其LD5

9、0>707.0mg/kg，長(zhǎng)期毒性無(wú)毒反應(yīng)劑量>35.35mg/(kg.d)×14d，根據(jù)等效劑量系數(shù)折算法，人的無(wú)毒反應(yīng)劑量劑量>222.71mg/(kg.d)×14d，即3117.87mg/kg，遠(yuǎn)高于臨床所需量，可以認(rèn)為在一定劑量范圍內(nèi)，該顆粒是安全的。Ang2-siRNA質(zhì)粒載體殼聚糖磁性納米微粒體內(nèi)靶向性研究證明了在外加磁場(chǎng)的作用下，該微粒能夠定向向靶組織移動(dòng)，具有靶向給藥系統(tǒng)載體的特性，可以作為一種可靠有效的靶向給藥載體，在