EGFR突變細胞系HCC827-TR獲得性耐藥機制及Afatinib逆轉(zhuǎn)耐藥研究.pdf

1、背景與目的:
　　肺癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，化療藥物因其毒副作用影響了對肺癌的治療價值。近年來隨著對肺癌發(fā)病機制及分子靶向治療深入研究，人們研究發(fā)現(xiàn)80％以上的肺癌患者EGFR高表達，針對EGFR分子治療的藥物有多種，其中EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶的小分子抑制劑，即EGFR-TKIs在臨床研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKIs對于大部分EGFR突變的患者，初始有非常好的療效，尤其對突變類型為19外顯子的缺失突變和21外顯子的L8

2、58R點突變患者，隨著藥物應用時間的延長，都不可避免的產(chǎn)生耐藥。關(guān)于獲得性耐藥的機制主要包括EGFR的T790M二次突變和MET基因擴增，約占70％，尚有30％-40％的耐藥機制不清楚，主要有PTEN表達缺失或功能異常、IGF-1R高表達、HGF高表達等。為進一步研究EGFR-TKIs獲得性耐藥機制，我們利用前期已經(jīng)誘導成功的耐藥細胞株HCC827-TR和敏感株HCC827-P，通過用不同方法對已知EGFR-TKIs獲得性耐藥機理的篩查

3、。
　　已知最常見的獲得性耐藥機制是EGFR的20外顯子發(fā)生T790M二次突變，而腫瘤的活性仍然依賴EGFR信號傳導通路，因此如何阻斷EGFR信號傳導通路是克服耐藥的關(guān)鍵。目前主要逆轉(zhuǎn)耐藥的研究包括聯(lián)合EGFR單抗治療、不可逆的EGFR-TKIs抑制劑和T790M突變抑制劑。本課題主要對不可逆的EGFR-TKIs抑制劑阿發(fā)替尼進行研究。介于H1975和H1650細胞株分別為EGFR外顯子21的點突變(L858R)和外顯子19的缺失

4、突變(E746-A750del)，其中H1975同時伴發(fā)外顯子20的二次突變(T790M)，我們選用H1975和H1650細胞株進行有關(guān)實驗，初步探討阿法替尼逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥可能性。
　　方法:
　　1.人體外培養(yǎng)HCC827-P、HCC827-TR細胞。提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過Realtime-PCR檢測二者細胞內(nèi)PTEN基因mRNA表達水平。
　　2.Western-blot檢測HC

5、C827-P和HCC827-TR細胞中PTEN的表達水平，同時檢測經(jīng)5μM Erlotinib處理2h后的HCC827-P和HCC827-TR細胞中EGFR下游靶蛋白p-AKT表達水平。
　　3.MTS檢測Afatinib和Erlotinib在H1975和H1650細胞系中的毒性作用。
　　結(jié)果:
　　1.Realtime-PCR檢測結(jié)果顯示HCC827-TR和HCC827-P細胞系中二者的PTENmRNA表達水平不一

6、致;其中HCC827-TR細胞系的PTEN基因mRNA表達水平較HCC827-P細胞系低。
　　2.Western-blot檢測顯示HCC827-TR細胞中PTEN蛋白表達缺失;給予EGFR-TKI抑制劑Erlotinib5μM處理2h后， HCC827-P細胞系的下游信號蛋白p-AKT明顯被抑制，未經(jīng)Erlotinib處理的HCC827-TR細胞中p-AKT水平輕度上調(diào)。
　　3.Afatinib對H1975存在生長抑制作

7、用。當Afatinib和Erlotinib藥物濃度均為10μM時，二者對H1975的生長抑制率分別為58％、14％，IC50分別為9.03μM和33.16μM。Afatinib對H1650的生長抑制作用強于Erlotinib，當Afatinib和Erlotinib藥物濃度均為0.001μM時，二者對H1650的生長抑制率分別為15％、6％，IC50分別為8.45μM和19.82μM
　　結(jié)論:
　　1.HCC827-TR對E