基于基因表達(dá)系列分析技術(shù)評價聚(D,L-乳酸)改性材料生物相容性的研究.pdf

1、生物材料的生物相容性評價對生物材料的研究具有重要的指導(dǎo)意義。為了全面分析評價生物材料的生物相容性,近年來許多研究都集中在生物材料與機(jī)體相互作用的機(jī)理研究上,其中尤以在分子水平探討生物材料與機(jī)體相互作用的機(jī)理是國內(nèi)外研究的一大熱點。本研究利用先進(jìn)的基因表達(dá)系列分析(SAGE)技術(shù),從轉(zhuǎn)錄組水平全面分析生物材料與機(jī)體相互作用的機(jī)制,建立一種全新的評價生物材料生物相容性的方法。
　　 聚乳酸是一種具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性的高分

2、子醫(yī)用生物材料。為了克服聚乳酸的臨床使用缺點和提高其親水性及細(xì)胞親和性,本研究采用馬來酸酐(MAH)對聚(D,L-乳酸)(PDLLA)進(jìn)行化學(xué)改性制備一種新型的馬來酸酐改性聚(D,L-乳酸)(MPLA)材料,考察了MPLA和PDLLA材料親/疏水性和材料表面形貌,并對MPLA和PDLLA材料的細(xì)胞生物相容性進(jìn)行評價。同時,采用LongSAGE方法,構(gòu)建了在MPLA和PDLLA材料上MC3T3-E1成骨細(xì)胞的LongSAGE文庫,并對MP

3、LA和PDLLA材料調(diào)控的差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析,從分子水平探索MPLA材料與細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制,評價其分子生物相容性。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　 (1)采用靜態(tài)水接觸角和吸水率方法檢測MPLA和PDLLA材料親/疏水性,同時采用原子力顯微鏡對MPLA和PDLLA材料表面形貌進(jìn)行觀察。
　　 ①親/疏水性研究結(jié)果表明,MPLA材料的水接觸角小于PDLLA材料的水接觸角,而MPLA材料的吸水率

4、大于PDLLA材料的吸水率,這說明MPLA材料的親水性優(yōu)于PDLLA材料。
　　 ②表面形貌研究結(jié)果表明,PDLLA和MPLA材料表面形貌基本相似。
　　 (2)從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞粘附和鋪展、細(xì)胞骨架、細(xì)胞增殖、以及細(xì)胞分化和礦化等幾個方面,對PDLLA和MPIA材料進(jìn)行了細(xì)胞生物相容性的評價。
　　 ①細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗的結(jié)果表明,MPLA材料有利于成骨細(xì)胞早期的附著和粘附,而并不影響該細(xì)胞正常的形態(tài)；
　　

5、 ②細(xì)胞粘附和鋪展實驗的結(jié)果表明,MPLA材料對細(xì)胞的粘附較強(qiáng),細(xì)胞粘附后鋪展的面積也較大;PDLLA材料對細(xì)胞的粘附較弱,細(xì)胞的鋪展面積也相應(yīng)較?。豢梢奙PLA材料對細(xì)胞粘附和鋪展有促進(jìn)作用；
　　 ③細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期實驗的結(jié)果表明,MPLA材料上成骨細(xì)胞具有較高的增殖活力,在接種初期增殖速率較快,可見MPLA材料對成骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用；
　　 ④細(xì)胞分化和礦化實驗的結(jié)果表明,MPLA材料上成骨細(xì)胞的ALP活性

6、以及分泌的無機(jī)鈣含量都顯著性高于PDLLA組和對照組,可見MPLA材料對成骨細(xì)胞的分化和礦化也有促進(jìn)作用。這些結(jié)果提示,MPLA材料比PDLLA材料具有更好的細(xì)胞生物相容性。
　　 (3)采用LongSAGE技術(shù),構(gòu)建了在MPLA和PDLLA材料上MC3T3-E1成骨細(xì)胞的LongSAGE文庫,為生物材料的生物相容性評價提供了一個新方法。
　　 (4)采用SAGE2000軟件和SAGEmap數(shù)據(jù)庫,對MPLA和PDLLA

7、材料作用的MC3T3-E1成骨細(xì)胞的LongSAGE文庫進(jìn)行分析研究。
　　 ①建立了PDLLA和MPLA兩個LongSAGE文庫,共獲得38484個標(biāo)簽。PDLLA文庫標(biāo)簽為19438個,特異性標(biāo)簽為6964種。而MPLA文庫標(biāo)簽為19046個,特異性標(biāo)簽7205種。結(jié)果顯示,PDLLA和MPLA兩個文庫中標(biāo)簽匹配情況和豐度分布情況都基本相同,表明兩者的標(biāo)簽數(shù)據(jù)具有可靠性和可比較性。
　　 ②相對于PDLLA文庫,MP

8、IA文庫中共有202個顯著性差異表達(dá)的標(biāo)簽,其中上調(diào)表達(dá)的標(biāo)簽有92個,而下調(diào)表達(dá)的標(biāo)簽有110個。結(jié)果顯示,MPLA材料都能有效地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞基因的表達(dá)。
　　 ③實時定量PCR檢測結(jié)果顯示,選擇的8個差異表達(dá)的基因(Aktls1、Calm1、Cdkn1a、Cf11、Fn1、Hdac1、Hdae5和Mt2)的差異表達(dá)的情況與LongSAGE實驗結(jié)果基本一致,驗證了LongSAGE實驗結(jié)果的可靠性。
　　 這些結(jié)果提示,

9、與PDLLA相比,MPIA材料中引入-COOH活性基團(tuán),其化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化能調(diào)控成骨細(xì)胞基因的差異表達(dá)。
　　 (5)采用GoSurfer軟件和KEGG數(shù)據(jù)庫,對PDLLA和MPLA材料作用的MC3T3-E1成骨細(xì)胞的LongSAGE文庫中篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和通路分析研究,以及對其分子機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 ①生物學(xué)過程的GO分析結(jié)果顯示,MPLA材料調(diào)控的差異表達(dá)基因主要富集的功能分類為細(xì)胞生理過程、細(xì)胞通訊

10、、細(xì)胞過程的調(diào)控、細(xì)胞分化、代謝、定位、應(yīng)激反應(yīng)及形態(tài)學(xué)等；
　　 ②分子功能的GO分析結(jié)果顯示,MPLA材料調(diào)控的差異表達(dá)基因主要富集的功能分類為蛋白質(zhì)結(jié)合、核酸結(jié)合、離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)運子活性、離子運輸活性、水解酶活性、氧化還原酶活性及轉(zhuǎn)移酶活性等；
　　 ③細(xì)胞組分的GO分析結(jié)果顯示,MPLA材料調(diào)控的差異表達(dá)基因主要富集的功能分類為細(xì)胞內(nèi)、膜、細(xì)胞內(nèi)器官、核蛋白復(fù)合體、質(zhì)子運輸ATP酶復(fù)合體、質(zhì)子運輸ATP

11、合成酶復(fù)合體以及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等；
　　 ④MPLA材料調(diào)控的上調(diào)基因主要參與調(diào)控了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架的組成、細(xì)胞激活、骨形成以及骨重建等生物學(xué)途徑;MPLA材料調(diào)控的下調(diào)基因主要參與調(diào)控細(xì)胞死亡、負(fù)調(diào)控凋亡、染色質(zhì)的修飾、細(xì)胞生理途徑、代謝途徑、以及生物合成等生物學(xué)途徑；
　　 ⑤KEGG通路分析結(jié)果表明,MPLA材料調(diào)控的差異表達(dá)基因主要參與調(diào)控了核糖體蛋白通路、氧化磷酸化通路、細(xì)胞周期通路、肌動蛋白細(xì)胞骨

12、架通路、蛋白酶體通路及溶酶體通路等。
　　 (6)MPLA材料與成骨細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制總結(jié)如下:
　　 ①由于MPLA材料表面的親水性的-COOH基團(tuán),通過調(diào)控了細(xì)胞的肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)通路及相關(guān)基因的表達(dá),有利于細(xì)胞早期的粘附和鋪展；
　　 ②MPLA材料作用后,通過調(diào)控核糖體通路,上調(diào)了核糖體蛋白基因的表達(dá),促進(jìn)核糖體蛋白的合成,同時增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)DNA合成和細(xì)胞分裂,促進(jìn)了細(xì)胞的生長和增殖；
　　 ③

13、MPLA材料作用后,通過調(diào)控氧化磷酸化通路,增加細(xì)胞的氧化磷酸化水平,增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝；
　　 ④MPLA材料通過調(diào)控蛋白酶體通路和溶酶體通路,有利于細(xì)胞的DNA損傷的自身修復(fù)和防御功能,同時調(diào)控細(xì)胞周期通路和P21基因表達(dá),防止細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞凋亡；
　　 ⑤MPLA材料作用后,抑制Hdac1和Hdac5基因的表達(dá),增強(qiáng)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)堿性磷酸酶和無機(jī)鈣的合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。
　　 上述結(jié)果提