改性聚(D,L-乳酸)與MC3T3-E1細胞的生物相容性.pdf

1、聚乳酸材料是具有良好生物相容性的合成生物可降解材料。采用馬來酸酐和丁二胺依次對聚（DL-乳酸）（DLPLA）進行化學改性，以提高材料的親水性，消除或減弱聚乳酸降解產物的酸性，促進材料與細胞之間的粘附，從而提高材料的生物相容性。在合成此類改性材料的基礎上，本文采用體外細胞培養(yǎng)法，以MC3T3-E1為模型細胞，將細胞與各基質材料復合培養(yǎng)，從細胞形態(tài)學、細胞附著與鋪展、細胞增殖與細胞周期、細胞生理功能以及I型膠原和OPN表達等方面考查細胞在丁

2、二胺改性聚乳酸（DPLA）、馬來酸酐改性聚乳酸（MPLA）和DLPLA上的細胞行為，綜合評價DPLA、MPLA和DLPLA與MC3T3-E1的生物相容性，為進一步的動物體內實驗和臨床應用提供理論依據(jù)主要工作和結論如下：
　　（1）材料的合成及其性能評價：將聚乳酸（DLPLA）沿馬來酸酐改性——脂肪族二胺改性的路線依次進行整體修飾，從而制備出新型仿生聚乳酸基質材料。其中，馬來酸酐的引入主要是給材料提供高反應活性的酸酐鍵；二胺的引入主

3、要是為了克服聚乳酸材料降解產物呈酸性的缺陷。采用羅丹明比色法、茚三酮顯色法和氨基酸分析儀檢測法對產物中的馬來酸酐、二胺進行定量測定。采用靜態(tài)水接觸角和吸水率對材料的親/疏水性能進行評價
　?。?）細胞培養(yǎng)：采用體外細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)前成骨細胞系 MC3T3-E1細胞；MC3T3-E1細胞常用于骨組織工程支架的生物相容性評價[1]，是目前被廣泛用于研究材料骨誘導能力的細胞系之一，可以用于材料上細胞相容性比較的實驗研究。
　　（3）

4、細胞在基底材料上的黏附和鋪展：相差顯微鏡觀察細胞與基底材料復合培養(yǎng)4h,8h,24h的生長情況，并拍照記錄。采用HE染色技術觀察MC3T3-E1細胞與基底材料上復合培養(yǎng)3d后的生長情況，并照相記錄。實驗結果表明：DPLA組的細胞密度高于MPLA組和DLPLA，而且DPLA組材料基底上的細胞形態(tài)呈三角形或短梭形，相對而言，MPLA和DLPLA上生長的細胞密度較小，表明細胞在DPLA上的形態(tài)學表現(xiàn)優(yōu)于在MPLA和DLPLA的。就細胞形態(tài)學表

5、現(xiàn)而言，DPLA具有比MPLA和DLPLA更好的細胞相容性。而且不同接枝率的DPLA對細胞形態(tài)有影響，接枝率高的改性材料更有利于細胞的鋪展；采用微吸管吸吮技術測細胞與基底材料復合培養(yǎng)0.5h和4h后的黏附力大小。實驗結果表明：DPLA更有利于細胞的黏附，且高含量的丁二胺改性材料更有利于細胞的黏附與鋪展。
　　（4）采用MTT法測定MC3T3-E1細胞接種在基質材料上后第2、4、6、8天的細胞增殖存活能力，繪出生長曲線；通過流式細胞

6、儀對與三種材料復合培養(yǎng)72h后細胞的細胞周期進行分析，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖能力及生長曲線因培養(yǎng)基底材料不同而不同。細胞在各組材料上都具有增殖能力，其中，在 DPLA上的細胞活性顯著大于在MPLA和DLPLA上的，MPLA組的要大于在DLPLA上的。DPLA能使進入分裂前期（G2/M）及分裂期（S）的細胞增多,而MPLA、DLPLA對細胞周期的影響較小,表明DPLA促進了細胞的增殖能力，促進細胞的分裂增殖。在促進增值分裂方面，DPLA具有比MP

7、LA和DLPLA更好的細胞相容性。高接枝率的丁二胺改性材料在促進細胞增殖跟分裂方面效果更好。
　?。?）采用BCA法，測定細胞與材料復合培養(yǎng)第5、10、15天后總蛋白質含量，比較三種材料對細胞活性的影響，采用酶動力法測定細胞在基底材料上第7、14、21天的堿性磷酸酶（ALP）活性。通過比色法對基底材料上細胞培養(yǎng)第5、10、15天鈣含量進行測定。實驗結果表明，培養(yǎng)第5天總蛋白含量DPLA高于其他組，MPLA組大于DLPLA組。培養(yǎng)第

8、10天各組蛋白質含量增加明顯；在各時間點，DPLA的堿性磷酸酶強度要高于其他材料組；在培養(yǎng)7天后，DPLA組細胞分泌的無機鈣水平高于其他組，DPLA促進了細胞成骨作用這一重要功能活動。以細胞生理功能而論，DPLA要比MPLA和DLPLA具有更好的細胞相容性。
　　（6）采用RT-PCR法檢測MC3T3-E1細胞Ⅰ型膠原mRNA的表達情況。采用Western blot法檢測MC3T3-E1細胞Ⅰ型膠原和骨橋素（OPN）的表達情況。結