核酸末端保護(hù)新方法的研究及其在生物檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子配體或者是和有機(jī)小分子結(jié)合的蛋白質(zhì)受體是至關(guān)重要的。尤其是，和特定蛋白質(zhì)具有合理親和性和特異性結(jié)合的有機(jī)小分子是非常有價(jià)值的探針探測(cè)蛋白質(zhì)功能用于化學(xué)基因組學(xué)的研究，并且可以視蹤蛋白質(zhì)在細(xì)胞上的位置和分布用于分子診斷學(xué)的探索，同樣，考察有機(jī)活性小分子和蛋白質(zhì)的相互作用也是藥物研究的主要出發(fā)點(diǎn)。目前，用于確定小分子配體、蛋白質(zhì)受體以及他們之間相互作用方法包括親和色譜、動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳、熒光共振

2、能量轉(zhuǎn)移、以及酶片段互補(bǔ)分析等。盡管這些經(jīng)典的分析方法對(duì)于研究小分子和靶蛋白的相互作用是非常重要的，但是這些方法需要有昂貴的儀器、特殊的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式、以及表面固定化等缺點(diǎn)。
　　 由于DNA寡核苷酸鏈據(jù)有靈活多樣的放大方法和檢測(cè)方式，小分子連接的DNA用于研究小分子和其結(jié)合蛋白相互作用無疑是一個(gè)比較吸引人的工具，為小分子和蛋白質(zhì)相互作用的研究提供了一個(gè)新的思路。小分子連接的DNA作為一個(gè)巧妙的工具越來越多的用于化合物的合成和篩選

3、。盡管如此，DNA連接的小分在生物傳感的研制方面仍然處于初始狀態(tài)，本論文針對(duì)這些問題，基于小分子連接的DNA和末端保護(hù)分析思想發(fā)展了一系列生物傳感方案用于小分子-蛋白質(zhì)相互作用的研究以及基因分型和酶的活性等和重大疾病相關(guān)的檢測(cè)。
　　 (1)小分子連接的DNA作為一個(gè)靈活的工具在探測(cè)有機(jī)小分子和小分子受體的相互作用的研究領(lǐng)域扮演了至關(guān)重要的角色。在第二章報(bào)道了小分子連接DNA的末端保護(hù)分析方法，這個(gè)分析是基于我們新的發(fā)現(xiàn)即單鏈D

4、NA末端修飾的小分子和小分子結(jié)合蛋白相互作用能夠保護(hù)單鏈DNA不被ExoⅠ降解。這個(gè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化小分子和蛋白質(zhì)相互作用的問題為DNA序列是否存在問題，因此可以用DNA序列的放大方法和檢測(cè)技術(shù)探測(cè)小分子-蛋白質(zhì)相互作用。
　　 基于上述思想，本章發(fā)展了一種靈敏的電化學(xué)生物傳感技術(shù)用于研究小分子蛋白質(zhì)相互作用。用小分子標(biāo)記的DNA通過非共價(jià)作用修飾于單壁碳納米管(SWNTs)的表面，使SWNTs能夠均勻地分散于水溶液中，若沒有小分子結(jié)合

5、蛋白的存在，Exo I能夠降解SWNTs表面的DNA鏈，使SWNTs在16-巰基十六酸(MHA)絕緣膜上自組裝，由于碳納米管的隧道效應(yīng)，使溶液中的電活性物質(zhì)和電極之間能夠有效的發(fā)生電子傳遞，產(chǎn)生電流信號(hào)；在小分子結(jié)合蛋白存在的情況下，由于結(jié)合蛋白和小分子作用阻礙了ExoⅠ對(duì)于SWNTs表面DNA寡核苷酸鏈的降解，DNA修飾的SWNTs不能在MHA絕緣膜上組裝，也就沒有電流信號(hào)產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這個(gè)發(fā)展的方案的確能夠?qū)嵸|(zhì)性地放大電化學(xué)信

6、號(hào)并且有較小的背景電流。用這種新奇的電化學(xué)傳感方案對(duì)小分子葉酸(FA)和腫瘤標(biāo)志物葉酸受體(FR)的相互作用進(jìn)行定量分析，動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍為10 pM到1 nM，檢測(cè)下限為3 pM。該方法靈敏度高，選擇性好。
　　 (2)基于末端保護(hù)分析思想結(jié)合DNA靈活多樣的檢測(cè)方式，在第三章中發(fā)展了幾種無標(biāo)記的光化學(xué)生物傳感技術(shù)用于小分子和蛋白質(zhì)相互作用的研究。具有催化活性的核酸酶(DNAzymes)作為催化標(biāo)記物用于生物傳感信號(hào)放大逐漸吸引了

7、更多的興趣，比如富含G的核酸適配體(Aptamer)和血紅素形成復(fù)合物能夠模擬過氧化氫酶的活性。因此，我們?cè)谘t素核酸適體3’末端修飾小分子，小分子和結(jié)合蛋白作用后阻礙Exo I對(duì)血紅素核酸適體的降解，核酸識(shí)體和血紅素結(jié)合在H2O2的存在下催化ABTS顯色，把這種顯色方法用于對(duì)FR定量檢測(cè)，線性檢測(cè)范圍是1nM～100 nM，檢測(cè)下限為0.1 nM。蛋白質(zhì)和標(biāo)記在DNA末端的小分子作用阻礙ExoⅠ對(duì)DNA鏈的降解，也可以對(duì)保留的DNA鏈

8、進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測(cè)，從而快速、靈敏檢測(cè)小分子結(jié)合蛋白，以葉酸-FR為模型體系，對(duì)FR檢測(cè)的線性范圍為100 fM～1 nM。一端小分子修飾另一端巰基修飾的DNA鏈通過金-巰鍵標(biāo)記到納米金上，小分結(jié)合蛋白和小分子相互作用阻礙了ExoⅠ對(duì)納米金上DNA鏈的降解，因此納米金顆粒能夠均勻地分散于緩沖溶液中，若沒有小分子結(jié)合蛋白的存在，納米金表面修飾的DNA鏈完全被ExoⅠ降解，納米金團(tuán)聚變色，因此引起納米金溶液顏色和吸光度值的

9、變化。基于末端保護(hù)分析構(gòu)建的納米金變色傳感器用于葉酸-FA的特異性檢測(cè)，檢測(cè)范圍是1nM～100 nM。本章發(fā)展的三種末端保護(hù)均相分析方法均具有操作簡(jiǎn)單，快速靈敏的特點(diǎn)。
　　 (3)鑒于前兩章中發(fā)展的電化學(xué)和光化學(xué)生物傳感方案是基于ExoⅠ的末端保護(hù)分析方法發(fā)展起來的，在第四章我們把末端保護(hù)的分析思想進(jìn)一步推廣，并且驗(yàn)證了DNA的3’或者5’末端修飾的小分子官能團(tuán)和目標(biāo)蛋白結(jié)合后同樣也能夠有效地阻止各種單鏈特異性核酸外切酶和雙

10、鏈特異性的核酸外切酶對(duì)DNA鏈的酶切降解。這個(gè)推廣把小分子-蛋白質(zhì)相互作用的分析轉(zhuǎn)化為對(duì)不同DNA結(jié)構(gòu)的分析，為小分子或者蛋白質(zhì)的檢測(cè)提供了一個(gè)有用的機(jī)制?；谶@種機(jī)制，本章發(fā)展了一種基于熒光染色的無標(biāo)記均相生物傳感方案用于小分子-蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)。同時(shí)，利用這種機(jī)制發(fā)展了一種基于聚合酶延伸單個(gè)小分子修飾的核苷用于無標(biāo)記的SNP基因分型檢測(cè)。
　　 小分子-蛋白質(zhì)相互作用以biotin-SA和FA-FR為模型體系分別對(duì)SA和

11、FR進(jìn)行檢測(cè)，動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍分別為0.5 nM～100 nM和1 nM～200 nM，檢測(cè)限分別為0.1 nM和0.4nM；SNP基因分型檢測(cè)的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍為0.1 nM～200 nM，檢測(cè)限為0.02 nM。除了較好的靈敏度之外，本章發(fā)展的方案也具有較高的選擇性、極好的重現(xiàn)性、低成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，使其在分子診斷、基因組研究方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 (4)由于前幾章中發(fā)展的末端保護(hù)分析方法適用于考察解離常數(shù)在納摩爾范圍的

12、小分子和蛋白質(zhì)作用分子對(duì)，為了更進(jìn)一步拓寬末端保護(hù)的分析應(yīng)用范圍，結(jié)合活性探針、光交聯(lián)技術(shù)、共價(jià)捕獲技術(shù)等最新發(fā)展的生物分析手段，把小分子修飾的DNA共價(jià)交聯(lián)到要檢測(cè)的目標(biāo)蛋白上，產(chǎn)生永久性的保護(hù)，可以使末端保護(hù)分析不受分子作用對(duì)解離常數(shù)的限制。在第五章中發(fā)展了一種基于共價(jià)捕獲的納米金變色生物傳感技術(shù)用于酶的活性檢測(cè)。把酶作用的底物通過巰基修飾到納米金上，使納米金能夠有效地分散于緩沖溶液中，用ExoⅠ和ExoⅢ降解處理后，納米金團(tuán)聚變色