反復間歇真空發(fā)酵過程中釀酒酵母適應性進化的系統(tǒng)分析.pdf

1、在纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程中，發(fā)酵液中存在多種可揮發(fā)性底物和產(chǎn)物(比如糠醛、乙酸)，它們會對釀酒酵母產(chǎn)生毒害作用，從而抑制發(fā)酵過程。反復間歇真空發(fā)酵法能夠有效的除去發(fā)酵液中的揮發(fā)性物質(zhì)，解除它們對發(fā)酵過程的抑制，從而實現(xiàn)高效的乙醇生產(chǎn)。但是微生物在真空發(fā)酵過程中會受到真空發(fā)酵環(huán)境的影響，細胞形態(tài)和細胞行為都會發(fā)生變化，這些變化同時也會影響真空發(fā)酵的生產(chǎn)效率。因此獲得對適應性酵母，并深入探究酵母對真空發(fā)酵的適應性與發(fā)酵性能之間的關(guān)系

2、，對實現(xiàn)纖維素水解液真空發(fā)酵生產(chǎn)乙醇至關(guān)重要。本研究從蛋白組、代謝組和脂質(zhì)組的角度分析原始酵母對反復間歇真空發(fā)酵(RBVF)的適應性進化機制；通過給氧活化的方法，獲得一株具有真空適應性的乙醇高產(chǎn)菌株；集成多組學系統(tǒng)的分析了原始酵母和適應性酵母對反復間歇真空發(fā)酵響應機制的差異，探究酵母適應性與發(fā)酵性能之間的關(guān)系。
　　 本研究中反復間歇真空發(fā)酵采用50 mba的真空壓力，通過間歇補料的方式控制糖濃度在20－100 g/L，歷經(jīng)42

3、0小時30個循環(huán)。發(fā)酵過程監(jiān)控結(jié)果顯示：從第13個循環(huán)開始酵母的活力減弱，死亡率上升，發(fā)酵能力下降，直到第30個循環(huán)酵母產(chǎn)乙醇能力又恢復，相當于第13個循環(huán)時的發(fā)酵水平，從而發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在反復間歇真空發(fā)酵中存在適應性過程。實驗發(fā)現(xiàn)有氧環(huán)境對從第13個循環(huán)取出的酵母的影響較大，因此通過對第13個循環(huán)的酵母給氧活化的方式，獲得了真空適應性乙醇高產(chǎn)菌株。與原始酵母相比，在反復間歇真空發(fā)酵中細胞存活率較高，為98％，其單位細胞的乙醇生產(chǎn)能力是原

4、始酵母的6倍。
　　 本文分別從蛋白質(zhì)組、代謝組和脂質(zhì)組三個方面分析了釀酒酵母對發(fā)酵過程的響應機制。1、蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對反復間歇發(fā)酵的響應過程中與碳中心代謝相關(guān)蛋白的上調(diào)，與熱激和氧化脅迫響應相關(guān)蛋白的上調(diào)，與細胞生長相關(guān)的基礎(chǔ)基因蛋白發(fā)生變化，說明碳中心代謝各途徑的再分配，氧化還原平衡的調(diào)控以及細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化可能是酵母細胞對反復間歇發(fā)酵的適應性進化途徑；2、代謝組分析揭示了酵母細胞對反復間歇真空發(fā)酵的適應性進化分

5、為三個階段。第一階段，酵母細胞感受到真空條件并產(chǎn)生應激反應，積累保護性物質(zhì)。第二階段，酵母基本適應真空發(fā)酵，保護性物質(zhì)的逐步下降。第三階段，酵母活力減弱，發(fā)酵能力下降。碳中心代謝途徑中間體代謝水平提高，與這些路徑相關(guān)的氨基酸含量的減少可能是酵母對反復間歇真空發(fā)酵的適應性進化表現(xiàn)；3、脂質(zhì)組學分析顯示，反復間歇真空發(fā)酵引起細胞活性減弱，發(fā)酵能力下降的重要原因可能是激活了酵母中麥角固醇的合成途徑中齒孔醇(eburicol)合成支路。同時酵母

6、細胞通過CDP-choline途徑，以及卵磷脂(PC)分子自身的轉(zhuǎn)化合成PC分子，以及增強短鏈PI和PC的方式適應細胞膜組成的變化需求。
　　 本研究集成蛋白組、代謝組、磷脂組分析了原始酵母和適應性酵母對反復間歇真空發(fā)酵的響應差異，揭示了適應性酵母對反復間歇真空發(fā)酵的適應性表現(xiàn)在對細胞膜組成麥角固醇/磷脂和細胞曲率(PE/PC)穩(wěn)定性的調(diào)控上。而適應性酵母的適應性是通過碳中心代謝途徑中糖酵解途徑被抑制，磷酸戊糖途徑被削弱，TCA