賴氨酸突變對(duì)人類干擾素調(diào)節(jié)因子7結(jié)合DNA能力的影響.pdf

1、干擾素調(diào)節(jié)因子7(Interferon regulator factors7，IRF-7)是調(diào)控I型干擾素表達(dá)的關(guān)鍵因子，因此在宿主抗病毒反應(yīng)中起關(guān)鍵的作用。在病毒感染細(xì)胞的過程中，IRF-7除了誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，其本身也能直接與病毒基因啟動(dòng)子相互作用，對(duì)病毒基因的表達(dá)加以調(diào)節(jié)。IRF-7作為干擾素調(diào)節(jié)因子家族(interferon regulatorfactors，IRFs)的成員，是通過與啟動(dòng)子中的干擾素刺激應(yīng)答原件(IFN-sti

2、mulationresponse elements，ISRE)結(jié)合來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。其活性很大程度上受其DNA結(jié)合能力的影響。
　　 IRF-7蛋白分子中一共有15個(gè)賴氨酸，分布在蛋白質(zhì)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，組成型激活結(jié)構(gòu)域，信號(hào)應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和抑制結(jié)構(gòu)域中。本文對(duì)IRF-7中的賴氨酸突變對(duì)其結(jié)合ISRE能力的影響進(jìn)行了研究。首先，本文構(gòu)建了一個(gè)原核表達(dá)質(zhì)粒：pET28a-FLAG-IRF7，能誘導(dǎo)表達(dá)帶His和FLAG雙標(biāo)簽的蛋白，

3、其中His標(biāo)簽用于純化，F(xiàn)LAG標(biāo)簽用于檢測(cè)。而后，將15個(gè)IRF-7的賴氨酸突變體的編碼序列亞克隆到這個(gè)質(zhì)粒中。利用構(gòu)建的16個(gè)原核表達(dá)質(zhì)粒，本文純化了IRF-7的野生型蛋白和15個(gè)賴氨酸突變體蛋白用于結(jié)合DNA活性的測(cè)定。
　　 利用建立的DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測(cè)系統(tǒng)，本文檢測(cè)野生型及賴氨酸突變體的IRF-7對(duì)ISRE的結(jié)合能力。ISRE探針序列來源于人類8型皰疹病毒(HumanHerpesvirus8，HHV-8)的開放讀框

4、57(ORF57)啟動(dòng)子中的ISRE元件。結(jié)果表明賴氨酸殘基突變成精氨酸后會(huì)對(duì)IRF-7的DNA結(jié)合能力產(chǎn)生一定的影響。其中45、61、92、120位點(diǎn)賴氨酸突變成精氨酸會(huì)使IRF-7完全喪失與ISRE的結(jié)合。本文的研究為探討IRF-7通過結(jié)合ISRE對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 在研究賴氨酸突變對(duì)IRF-7的DNA結(jié)合能力影響的同時(shí)，本文利用大腸桿菌SUMO修飾系統(tǒng)研究了IRF-7野生型及各賴氨酸突變體蛋白的SUMO修