發(fā)酵型蜂蜜桑椹酒的釀造技術(shù)及品質(zhì)特征研究.pdf

1、桑椹為桑（Morus alba Linn．）的成熟果穗，是國家衛(wèi)生部1988年首批公布的醫(yī)食同源植物品種之一，我國桑椹產(chǎn)量位居世界首位。桑椹屬于熱性漿果，極不耐貯，易腐爛、變質(zhì)。桑椹富含糖、酸、維生素、礦物元素，還含有花色苷、酚酸和黃酮等多種活性物質(zhì)。本文將天然蜂蜜與桑椹結(jié)合，釀制營養(yǎng)全面的復(fù)合型果酒，不僅符合了酒類行業(yè)的發(fā)展趨勢，而且還將打造出綠色的保健果酒品牌，迎合當(dāng)今消費(fèi)及市場需求。目前，我國幾乎沒有蜂蜜桑椹酒的釀造技術(shù)和品質(zhì)特征

2、方面的系統(tǒng)性研究。 本論文以蜂蜜和桑椹為主要原料，應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物分離技術(shù)，結(jié)合生物技術(shù)和儀器分析技術(shù)，采用理化指標(biāo)分析結(jié)合感官評定技術(shù)，對桑椹和桑園土壤中優(yōu)良酵母菌的分離、篩選和鑒定，蜂蜜桑椹酒釀造酵母菌株的構(gòu)建，蜂蜜桑椹酒的發(fā)酵工藝及澄清條件，蜂蜜桑椹酒的基本化學(xué)成分和香氣成分分析等方面進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究。在蜂蜜桑椹酒的專用菌株、發(fā)酵工藝及品質(zhì)特征等方面取得了較大的研究進(jìn)展。主要研究結(jié)果為： 1、從成熟桑椹和桑園土

3、壤的富集培養(yǎng)液，以及蜂蜜桑椹汁的自然發(fā)酵液中，共分離得到112株酵母菌。經(jīng)逐級篩選，優(yōu)選出兩株酵母菌，命名為HM和SM。HM分別在酒精濃度16%，SO2濃度250 mg/L，pH2．01時，1d內(nèi)產(chǎn)氣；SM在酒精濃度14%時，1．5d內(nèi)產(chǎn)氣，在SO2濃度200 mg/L時，1d內(nèi)產(chǎn)氣，在pH1．50時，2d內(nèi)產(chǎn)氣。HM和SM發(fā)酵蜂蜜桑椹汁，酒精度分別為9．7%，7．0%（V/V），總酯產(chǎn)量分別為1890．5，2143．8（mg/L），感

4、官綜合得分分別為84．9，83．1（分），發(fā)酵酒具有素雅的桑果香和怡人的酒香，典型性突出。鑒定結(jié)果表明，酵母菌HM為酵母屬的釀滔酵母（Saccharomyces cerevisive），酵母菌SM為有孢圓酵母屬的德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）。 2、對原生質(zhì)體融合的各種技術(shù)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)論如下： （1）確定以Y1（n）（單倍體Y1（a12））和HM（n）（單倍體HM（a4））為

5、原生質(zhì)體融合的兩個親本菌株。確定含2．0mg/mLCuSO4的完全培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上，Y1（n）能生長而HM（n）不能生長。 （2）原生質(zhì)體形成和再生條件：將Y1（n）在YEPD中培養(yǎng)4h（28℃和180r/min）后，用含0．1%β-巰基乙醇的預(yù)處理劑處理10min（30℃和180r/min），再用含1．0%蝸牛酶的酶解液處理1．0h（30℃和120r/min），原生質(zhì)體形成率達(dá)到94．2%，再生率達(dá)到27．1

6、%；將HM（n）在YEPD中培養(yǎng)5h（28℃和180r/min）后，用含0．1%β-巰基乙醇的預(yù)處理劑處理10min（30℃和180r/min），再用含1．5%蝸牛酶的酶解液處理1．5h（30℃和120r/min），原生質(zhì)體形成率達(dá)到95．4%，再生率達(dá)到22．2%。在原生質(zhì)體形成時用0．7mol/LKCI來配制酶解溶液，而在原生質(zhì)體再生時，用17%蔗糖來配制稀釋液和高滲再生培養(yǎng)基。 （3）Y1（n）原生質(zhì)體滅活條件：60℃恒溫

7、水浴處理20min，滅活率達(dá)到100%。 （4）兩親本菌株按1：1比例混合（濃度均為1×107個/mL），于30℃和180r/min條件下培養(yǎng)15min，加入促融劑溶液，振蕩10 nun，再靜止10 min，融合率達(dá)到4．85×10-6。 （5）篩選及鑒定：通過TTC顯色法和杜氏管發(fā)酵法初步篩選出10株發(fā)酵能力較強(qiáng)的融合子；通過釀造酒復(fù)篩試驗(yàn)，結(jié)合模糊綜合評判法優(yōu)選出F6和F10兩株融合子，以F6最佳。細(xì)胞的形態(tài)、大小、

8、DNA含量和抗藥性分析結(jié)果表明，融合子F6和F10為兩親本菌株真正的融合子。 （6）遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)：融合子F6和F10經(jīng)連續(xù)傳代20次后，其主要性能仍然很穩(wěn)定，沒有發(fā)生同復(fù)突變現(xiàn)象，說明兩融合子具有遺傳穩(wěn)定性。 （7）通過基本生理特性和發(fā)酵性能比較，揭示了融合子和親本之間的相互關(guān)系。 3、融合子F6的發(fā)酵工藝條件包括：桑椹最佳果膠酶酶解條件為酶解溫度35℃，酶用量為每kg桑椹漿添加0．4mL諾維信酸性果膠酶BEC

9、，酶解時間100min，自流汁得率為14．826%。初始糖度以24%（還原糖220 g/L左右）為宜。采用濁汁發(fā)酵，在后期通過下膠對原酒進(jìn)行澄清處理。研究了發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值、SO2添加量和裝液量五個因素影響主發(fā)酵過程的具體情況：建立了主發(fā)酵質(zhì)量預(yù)測模型為Y=88．64936-6．19732X1+1．49109X2+2．88565X3－4，08817X12－2．49718X32+1．62500X1X2+1．37500X2X3<

10、X1-發(fā)酵溫度，X2-接種量，X3-初始pH值），優(yōu)化的主發(fā)酵條件為溫度23℃，接種量10%（VN）和pH值3．5。后發(fā)酵溫度選擇10～15℃。澄清試驗(yàn)結(jié)果表明，以殼聚糖0．6g/L+PVPP1．0g/L復(fù)合的澄清效果最好，透光率達(dá)到60．6%，色度值為12．8，澄清處理后的酒樣在酒度、糖含量和酸含量上沒有變化，酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)被澄清劑絮凝去除而減少，提高了蜂蜜桑椹酒的穩(wěn)定性。 4、分別以大十桑椹、紅果2號桑椹和紅果1號桑椹和農(nóng)

11、用桑椹為原料，發(fā)酵得到四種蜂蜜桑椹酒，分析了它們含有的各種成分。四種酒樣在總糖、總酸、pH值、酒度、揮發(fā)酸和單寧等成分上差異不大，但蛋白質(zhì)含量差異較大。各種礦物元素的含量因品種不同而存在一定差異，但均表現(xiàn)出高鉀低鈉的突出特點(diǎn)，鎂元素含量很高，硒元素含量5．0～8．5μg/L。氨基酸總含量和必需氨基酸含量以紅果1號桑椹蜂蜜發(fā)酵酒最高，而農(nóng)用桑椹蜂蜜發(fā)酵酒最低；必需氨基酸含量占氨基酸總量的比例在四種酒樣間差異不明顯；從氨基酸種類含量來看，四

12、種酒樣在氨基酸組分上的差異顯著（p<0．05）。蜂蜜桑椹酒的總二氧化硫、游離二氧化硫及有害微生物指標(biāo)的檢測結(jié)果符合國家發(fā)酵酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。 對蜂蜜桑椹酒中多酚類物質(zhì)的情況進(jìn)行了較詳細(xì)的研究。結(jié)果表明，農(nóng)用桑椹蜂蜜發(fā)酵酒的總酚、總黃酮和總花色苷含量最高，而紅果1號桑椹蜂蜜發(fā)酵酒最低，大十桑椹和紅果2號桑椹蜂蜜發(fā)酵酒居中。進(jìn)一步對酒樣中7種酚酸和5種黃酮醇進(jìn)行了分析，建立了高效液相色譜分析方法，采用Agilent Analytical

13、CI8色譜柱（250mm×4．6mm，5．0μm），酚酸測定方法為：流動相為甲醇-甲酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速1．0mL/min，柱溫30℃，檢測波長260nm，進(jìn)樣量20μL；黃酮醇測定方法為：流動相為甲醇－乙酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速1．0mL/min，柱溫30℃，檢測波長360nm，進(jìn)樣量20μL。測定結(jié)果表明，蜂蜜桑椹酒中原兒茶酸、槲皮素和桑色素的含量很高，這可能是其區(qū)別于其它果酒的重要特征：各種酚酸和黃酮醇類物質(zhì)在不同酒種之間存在

14、一定程度的差異，以酚酸中的咖啡酸和黃酮醇中的蘆丁含量差異最大，這兩種物質(zhì)可能是區(qū)別不同酒種的重要依據(jù)。 5、從大十桑椹、紅果2號桑椹、紅果1號桑椹和農(nóng)用桑椹四種果汁中共檢出64種揮發(fā)性成分，主要成分包括亞油酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、油酸、亞油酸乙酯、亞油酸甲酯、亞麻酸乙酯、油酸甲酯、3-甲基-丁醇、苯乙醇、2，3-丁二醇、己醛、壬醛和3-羥基-2-丁酮等。以四種桑椹為原料，發(fā)酵得到四種蜂蜜桑椹酒，從四種原酒中共檢出93種揮發(fā)性成分，

15、主要成分包括3－甲基-1－丁醇、2－甲基-1-丙醇、苯乙醇、2，3－丁二醇、4－羥基苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸單乙酯、乳酸乙酯、油酸甲酯、乙酸、葵酸、辛酸、3－羥基-2-丁酮等；從四種陳釀酒中共檢出76種揮發(fā)性成分，主要成分包括3－甲基－1－丁醇、2-甲基-1-丙醇、苯乙醇、2，3－丁二醇、1，2，3－丁三醇、4-羥基苯乙醇、3-甲基－丁酸乙酯、2-羥基－丙酸乙酯、乙酸乙酯、3-羥基-2-丁酮等。桑椹從果汁經(jīng)歷發(fā)酵和陳釀作用，香氣成分的種

16、類和相對百分含量變化很大，總體變化趨勢為：低級脂肪酸酯上升，高級脂肪酸酯下降；低級脂肪醇上升，高級脂肪醇變化小，芳香醇上升；低級脂肪酸先升后降，高級脂肪酸大幅下降；酮類上升，醛類下降，酚類先升后降。 本文首次采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，結(jié)合模糊綜合評判方法，構(gòu)建得到適合蜂蜜桑椹酒釀造用的新菌株，該菌株發(fā)酵性能優(yōu)良，且遺傳穩(wěn)定性好；首次對不同品種蜂蜜桑椹酒中各種基本化學(xué)成分進(jìn)行了較全面的研究，著重分析了含有的多酚類物質(zhì)的情況，初步建立了