副溶血弧菌常規(guī)調查及其3種基因(tlh、tdh及trh)LAMP檢測方法的研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種重要的食源性致病菌，人們食用受該菌污染的食物后會引起腹瀉、嘔吐等癥狀，甚至導致脫水、休克及死亡。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模呈明顯擴大趨勢，已成為我國首要的食源性致病菌。因此，對副溶血弧菌進行常規(guī)調查，了解其分布、形態(tài)和類型以及發(fā)展新型副溶血弧菌檢測方法就顯得尤為重要。當前，雖然國內外已有采用環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamp

2、lification，LAMP)檢測副溶血性弧菌的相關報道，但是仍存在成本高、耗時長、不穩(wěn)定和易污染等不足，因此迫切需要一種新型的檢測副溶血弧菌的方法。
　　 目的：了解市售水產品中副溶血弧菌污染情況并建立簡便、快速和靈敏的新型LAMP檢測副溶血弧菌基因tlh，tdh和trh的方法。
　　 方法：一、在食物中毒高發(fā)季節(jié)采集魚、蝦、貝、蟹及頭足5類20種共161份樣本，然后按照傳統(tǒng)培養(yǎng)法和生理生化法進行副溶血弧菌分離和鑒定

3、，之后采用普通PCR法檢測副溶血弧菌的tlh堪因進行驗證，并對其毒力基因(tdh和trh)進行檢測和分布統(tǒng)計分析，最后采用11種O群分群血清對分離到并驗證的副溶血弧菌進行血清分群研究。二、針對副溶血弧菌種特異性基因.不耐熱溶血毒素基因(砌)的6個特異性位點設計1套LAMP引物，通過對反應體系(鎂離子濃度、甜菜堿濃度、內外引物比及環(huán)引物加入與否)及反應條件(反應溫度和反應時間)的優(yōu)化建立副溶血弧菌的LAMP檢測法，之后通過采用LAMP法檢

4、測74株實驗菌評價其特異性，通過采用LAMP法檢測梯度稀釋的標準菌基因組DNA、純培養(yǎng)的副溶血弧菌及貝類模擬樣本評價其檢測敏感性，并與普通PCR法檢測敏感性對比分析評價其應用價值。三、針對副溶血弧菌種特異性基因-溶血毒素基因(tdh及trh)的6個特異性位點分別設計1套LAMP引物，采用新建的LAMP法體系和條件對74株食源性病原菌分別進行tdh和tlh基因的LAMP檢測，觀察其檢測特異性并評價該方法的現(xiàn)場應用價值。
　　 結果

5、：一、通過傳統(tǒng)方法分離和鑒定及PCR驗證，161份樣本中共檢出副溶血弧菌45株，平均檢出率為27.95％，不同種類水產品中Vp的檢出率有顯著性差異(x2=11.20，0.01

6、5)、O：10群占8.9％(4/45)、O：11群占26.7％(12/45)。二、反應體系和條件的優(yōu)化表明，tlh基因的LAMP檢測在8mM鎂離子、0M甜菜堿、8:1的內外引物比、加入40mM環(huán)引物的反應體系，60℃反應55分鐘即可完成；該方法檢測74株實驗菌中副溶血弧菌均陽性，其它菌和空白對照都陰性；該方法檢測標準菌基因組DNA最低檢測限可達到1fg，檢測純培養(yǎng)物最低檢測限為2.53×102CFU/mL(較普通PCR高1000倍)，檢

7、測貝類模擬樣本最低檢測限為9.42×102CFU/g(較普通PCR高1000倍)。三、tdh的LAMP檢測法檢測74株食源性病原菌中，7株含tdh基因的副溶血弧菌均為陽性，其余均為陰性；trh基因的LAMP檢測法檢測74株食源性病原菌中，1株含trh基因的副溶血弧菌為陽性，其余均為陰性。
　　 結論：本研究副溶血弧菌常規(guī)調查對上海市市售水產品中副溶血弧菌的分布情況提供了部分參考依據(jù)，同時本研究建立的以tlh、tdh和trh基因為