大型溞ChE免疫測(cè)定：有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的生物指示.pdf

1、本文探索了從大型溞體內(nèi)提取和純化ChE的適宜條件，在此基礎(chǔ)上按此對(duì)酶進(jìn)行了分離提純，得到了基本達(dá)電泳純的大型溞ChE，進(jìn)而對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了初步的了解，檢測(cè)了ChE的底物特異性以及抗抑制性。通過(guò)將純化的大型溞ChE免疫小鼠，得到了較高效價(jià)的小鼠多克隆抗血清，從而建立了能夠定量測(cè)定大型溞體內(nèi)微量的ChE-IR的間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，并利用所建立的方法進(jìn)行了一些活體測(cè)定。主要研究成果如下：
　　 通過(guò)提取和純化大型溞ChE的適宜條件的

2、摸索，確定了大型溞ChE粗提取純化的最佳條件組合是：pH7.5、0.25％(V/V)Triton X-100、60％～100％硫酸銨沉淀；經(jīng)過(guò)超聲破碎、Triton X-100提取、硫酸銨鹽析和DEAE-Sephrose-Fast-Flow陰離子柱層析，一種純度已達(dá)電泳純的ChE被成功從大型溞體內(nèi)分離出來(lái)。以粗提物為起點(diǎn)，該純化過(guò)程對(duì)酶的純化倍數(shù)和純化回收率分別為62倍和19％，大約有400ug左右的比活力為330.8U/mg prot

3、ein的ChE被從4g左右的大型溞體內(nèi)純化出來(lái)。該酶的分子量經(jīng)測(cè)定為84KDa。底物特異性研究表明，此酶既能水解ATCh，也能水解BTCh，以ATCh和BTCh為底物，Km和Vmax分別為0.1498mmol/L、0.1098U/mL和0.2878mmol/L、0.1348U/mL，對(duì)ATCh大于BTCh；并且出現(xiàn)高濃度底物抑制現(xiàn)象。抗抑制性試驗(yàn)表明，被提純的ChE對(duì)iso-OMPA的敏感性明顯高于BW284C51。以上種種結(jié)果表明所純

4、化出的ChE為非典型的丁酰膽堿酯酶(PChE)。
　　 本論文第一次證實(shí)大型溞體內(nèi)含有不止一種形式的膽堿酯酶，其中0～45％飽和度硫酸銨沉淀組分中主要含有AChE形式的膽堿酯酶；而60％～100％飽和度硫酸銨沉淀組分中主要含有PChE形式的膽堿酯酶。
　　 用純化的大型溞ChE免疫BALB/c小鼠后，得到效價(jià)達(dá)1：8000的多克隆抗血清，抗原抗體最適工作濃度測(cè)定結(jié)果顯示最適抗原濃度為6ug/mL，抗血清最適稀釋倍數(shù)是1：

5、8000；建立了測(cè)定大型溞ChE-IR的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=a(1-e-bx)，其中a=1.6469638，b=0.13443779，相關(guān)系數(shù)r=0.99444916，標(biāo)準(zhǔn)誤差S=0.07151367；建立的間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法在不同蛋白濃度的批內(nèi)、批間和整體的變異系數(shù)均小于10％，靈敏度為0.24ng/mL，回收率介于92.9～102％之間，達(dá)到了ELISA質(zhì)量控制要求。本實(shí)驗(yàn)獲得的抗血清與非膽堿酯酶類(lèi)的Marker和其他生物(搖蚊、斑

6、馬魚(yú)、家蠶、蜜蜂、蚯蚓、非洲爪蟾蝌蚪等)的ChE交叉反應(yīng)率低。在抗原特異性方面，本實(shí)驗(yàn)證明大型溞體內(nèi)ChE不與多肽合成的N端和C端兔Anti-BChE抗體反應(yīng)。可見(jiàn)測(cè)定大型溞體內(nèi)ChE的間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法特異性高，本研究的意義在此得到體現(xiàn)。
　　 利用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的活體測(cè)定中，樣品25℃放置一周，酶活性失活顯著，隨著酶活性的失活，總蛋白含量和ChE-IR也呈下降趨勢(shì)，但是ChE-IR下降趨勢(shì)較為緩慢，可見(jiàn)ChE

7、-IR是一個(gè)比較穩(wěn)定的測(cè)試指標(biāo)；通過(guò)測(cè)定10℃和25℃下培養(yǎng)的大型溞體內(nèi)的ChE-IR以及酶活性，可以明顯的看出10℃培養(yǎng)的大型溞體內(nèi)ChE-IR明顯提高，比25℃高將近10倍，經(jīng)過(guò)LSD顯著性分析，5％水平上具有顯著性差異?？梢?jiàn)低溫對(duì)大型溞體內(nèi)ChE產(chǎn)生了誘導(dǎo)。對(duì)ChE合成的刺激應(yīng)該是生物體對(duì)有機(jī)磷和低溫脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制；毒性試驗(yàn)表明，三唑磷和氰戊菊酯對(duì)大型溞急性毒性48-LC50值分別為0.00174mg/L和0.000900mg

8、/L。在0.00033mg/L(大約為48-LC50值的1/5)三唑磷的脅迫下，大型溞體內(nèi)ChE-IR受誘導(dǎo)現(xiàn)象比較明顯，第6d誘導(dǎo)率為72.4％，與CK和其它兩個(gè)處理(0.001mg/L和0.002mg/L)差異顯著。非ChE抑制劑的氰戊菊酯在所測(cè)濃度(0.000014mg/L、0.0000187mg/L、0.00002mg/L)范圍內(nèi)，對(duì)大型溞體內(nèi)ChE-IR均無(wú)明顯誘導(dǎo)。并且得出以酶蛋白含量衡量酶活性是符合生物規(guī)律并且比較準(zhǔn)確的生