不同信號(hào)肽對(duì)脂肪酶A在枯草芽孢桿菌中分泌表達(dá)的影響.pdf

1、脂肪酶(1ipase，EC3.1.1.3)是一類能在油水界面上催化三酯酰甘油水解為甘油和長(zhǎng)鏈脂肪酸的酶類，可以催化酯水解、酯交換、酯合成等多種反應(yīng)，并被廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域。來(lái)源于芽孢桿菌屬的脂肪酶因其良好的耐熱性和耐堿性而具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。然而在短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用傳統(tǒng)的誘變野生菌的方法篩選出具有某些特定性質(zhì)的脂肪酶高產(chǎn)菌株是不現(xiàn)實(shí)的，所以用基因工程方法生產(chǎn)脂肪酶己成為必然。
　　 枯草芽孢桿菌作為傳統(tǒng)的

2、工業(yè)生產(chǎn)菌，具有極強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，是研究蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌的良好系統(tǒng)。利用枯草芽孢桿菌信號(hào)肽引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)定位分泌到細(xì)胞特定區(qū)間，可提高外源蛋白質(zhì)的可溶性，避免因包涵體復(fù)性帶來(lái)的產(chǎn)物純化等困難。然而，同一種蛋白質(zhì)在不同信號(hào)肽的作用下，分泌效率往往相差甚遠(yuǎn)，有的甚至不能實(shí)現(xiàn)分泌。因此，研究信號(hào)肽與目的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，可用以指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)分泌表達(dá)中信號(hào)肽的選擇，進(jìn)而為外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 本文以B.sub

3、tilis168來(lái)源的脂肪酶A作為研究對(duì)象，構(gòu)建了高效分泌表達(dá)載體pMA5△MCS-lipA，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，得到脂肪酶分泌表達(dá)重組菌株WB600(pMA5△MCS-lipA)。經(jīng)20 h搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，分泌到胞外的脂肪酶活力達(dá)到最高，為7.64 U/mL，是出發(fā)菌株WB600最高酶活(0.02 U/mL)的382倍。對(duì)其生長(zhǎng)特性和穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，該重組菌株生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量與出發(fā)菌株WB600相當(dāng)；分離穩(wěn)定性很好，在無(wú)選擇壓

4、力的情況下連續(xù)傳100代，細(xì)胞仍98％帶有質(zhì)粒；結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究表明重組菌株在無(wú)選擇壓力的情況下連續(xù)傳60代，可正確表達(dá)lipA基因的重組菌株占總菌株數(shù)的76.5％；傳到100代時(shí)，這一比值降到43.6％，但仍可滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。
　　 為了研究不同信號(hào)肽對(duì)脂肪酶分泌效率的影響，本文還選取了AprE，LipB，WapA，WprA四種蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列，替換pMA5△MCS-lipA中l(wèi)ipA基因信號(hào)肽序列，構(gòu)建了一系列分泌表達(dá)載

5、體。分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，得到重組菌株WB600(pMAaprE-lipA)，WB600(pMAlipB-lipA)，WB600(pMAwapA-lipA)，WB600(pMAwprA-lipA)。各重組菌株發(fā)酵20 h后，脂肪酶分泌表達(dá)情況有顯著差異。最高酶活分別達(dá)到0.55 U/mL，1.38 U/mL，0.18 U/mL和0.77 U/mL。分別以WB600(pMA5△MCS-lipA)和WB600作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，結(jié)