提升光滑球擬酵母酸耐受性加強(qiáng)丙酮酸合成.pdf

1、在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸過(guò)程中，發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)速率往往隨著有機(jī)酸的積累而受到抑制，如何消除或減輕這種由目標(biāo)代謝產(chǎn)物有機(jī)酸積累而引起的酸脅迫抑制，是獲得有機(jī)酸發(fā)酵過(guò)程中高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的關(guān)鍵。因此，本論文以一株能在胞外大量積累丙酮酸的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)四重維生素（硫胺素、生物素、吡哆醇和煙酸）營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株CCTCC M202019為出發(fā)菌株。通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化篩選獲得了一株耐受pH1.91的突

2、變菌株RT-6，比較了其耐酸性和發(fā)酵特性，對(duì)其耐酸性機(jī)理進(jìn)行了探討，最后進(jìn)一步優(yōu)化了突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分，為了解光滑球擬酵母酸脅迫耐受機(jī)理及提高丙酮酸產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。主要研究成果如下：
　　 1．考察了丙酮酸發(fā)酵過(guò)程中的積累，主要從兩個(gè)方面抑制菌株發(fā)酵：一方面通過(guò)降低培養(yǎng)基pH;另一方面通過(guò)丙酮酸本身毒性。之后通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化，連續(xù)轉(zhuǎn)接處于低pH條件下的菌株，經(jīng)2160代進(jìn)化篩選獲得了一株突變株RT-6，從菌濃、丙酮酸產(chǎn)量及胞外

3、pH三方面考察了突變株RT-6耐酸性，發(fā)現(xiàn)突變株RT-6耐酸性得到明顯提高。同時(shí)，突變株RT-6對(duì)其它種類有機(jī)酸，如丙酸、檸檬酸、乳酸及乙酸的耐受性也明顯提高。發(fā)酵結(jié)果表明，突變株RT-6在正常條件(pH5.5)與酸性條件下(pH4.7)的最終菌濃分別比原菌提高了21.5％和61.8％，丙酮酸產(chǎn)量分別提高了15.5％和51.8％。
　　 2．比較了突變株RT-6與原菌在正常條件與酸性條件下胞內(nèi)pH、ATP、H+-ATPase、膜

4、脂肪酸、聚磷酸鹽生理參數(shù)的差異。結(jié)果表明：突變株胞內(nèi)pH維持較高水平，從7.11(pH5.5)降低至5.37(pH4.0)，而原菌從7.03(pH5.5)降低至5.08(pH4.0);突變株胞內(nèi)ATP、H+-ATPase酶活和聚磷酸鹽含量分別提高了：11.8％、13.6％、3.5％(pH5.5)和61.1％、38.6％、30.9％(pH4.0)；突變株膜脂肪酸不飽和度增強(qiáng)，膜的流動(dòng)性更強(qiáng)。
　　 3．對(duì)突變株RT-6發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)

5、行優(yōu)化，通過(guò)單因素篩選確定了最佳氮源為尿素；以丙酮酸產(chǎn)量為目標(biāo)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分的各個(gè)單因素水平進(jìn)行濃度優(yōu)化，最終確定了尿素、乙酸鈉和磷酸二氫鉀濃度依次為7g/L、3g/L和3g/L。以優(yōu)化的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基上罐驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)菌濃和丙酮酸量分別提高了23.1％和24.6％，丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高了29.6％。為降低過(guò)高菌濃，使更多的碳流流向丙酮酸方向，我們對(duì)維生素B1濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳濃度為0.012mg/L，發(fā)酵結(jié)束后菌濃降低了28.7％，