促血小板生成因子-重組酪氨酰tRNA合成酶的研制.pdf

1、血小板減少癥(Thrombocytopenia)是臨床上的常見病和多發(fā)病，腫瘤的放療、化療，骨髓移植及慢性肝臟疾病都能誘導(dǎo)產(chǎn)生血小板減少癥。當(dāng)血小板數(shù)目降低至20，000/mm3時(shí)，就需要進(jìn)行血小板輸注，但血小板的污染及抗體的形成都會(huì)影響輸血的效果。臨床上常用血小板濾器或選擇與HLA相同的血小板以減少抗血小板抗體的形成。
　　目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子可以促進(jìn)血小板的生成，如干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-1(IL-1)、白

2、介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、白介素-3(IL-3)與粒細(xì)胞集落刺激生物因子(GM-CSF)的融合蛋白PIXY-321，促血小板生成素(TPO)都開始用于治療放化療導(dǎo)致的血小板減少癥。這些細(xì)胞因子在前期的臨床實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出刺激巨核細(xì)胞增殖及促進(jìn)血小板生成的作用，但在臨床試驗(yàn)中，它們的療效并不盡如人意，出現(xiàn)了很多嚴(yán)重的毒副作用。因而尋找一種更安全有效地提升血小板的藥物具有極為重要的意義。

3、　　許多氨酰tRNA合成酶具有細(xì)胞因子功能，其中人酪氨酰tRNA合成酶第341位氨基酸發(fā)生突變后具有促進(jìn)血小板生成的功能。本研究為了證明第341位氨基酸發(fā)生突變的重組人酪氨酰tRNA合成酶(rhTyrRS)突變體具有治療化療后血小板減少癥的作用，將通過(guò)三個(gè)部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn):一、rhTyrRS(Y341A)的藥效學(xué)和急性毒性研究。建立小鼠血小板減少模型，通過(guò)腹腔注射給藥并定期檢測(cè)小鼠血小板，解剖小鼠后對(duì)各組織臟器進(jìn)行H&E染色及觀察巨核細(xì)胞情

4、況;二、rhTyrRS(Y341A)的作用機(jī)理與信號(hào)通路。通過(guò)M07-e細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)和THP-1與HUVEC細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)分析rhTyrRS(Y341A)促血小板生成的機(jī)理。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析rhTyrRS(Y341A)與和NFκB信號(hào)通路的關(guān)系。三、rhTyrRS(Y341A)的中試研究。通過(guò)中試發(fā)酵并純化得到大量具有生物活性的蛋白，經(jīng)過(guò)一系列質(zhì)量檢定和驗(yàn)證后，制成注射用粉針劑;
　　一、rhTyrRS(Y341A)的藥效學(xué)

5、和急性毒性研究
　　小鼠連續(xù)7天腹腔注射1μ g/kg，10μ g/kg，100μ g/kg劑量的rhTyrRS(Y341A)，以5μ g/kg TPO為陽(yáng)性對(duì)照，PBS為陰性對(duì)照，生理鹽水為空白對(duì)照，定期剪尾取血分析血小板數(shù)目變化。實(shí)驗(yàn)第8天通過(guò)皮下注射環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)血小板減少癥，持續(xù)取血分析血小板數(shù)目變化。最后將小鼠解剖后對(duì)各臟器進(jìn)行H&E染色觀察，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)巨核細(xì)胞在骨髓中的分布。結(jié)果顯示連續(xù)7天注射rhTyrRS

6、(Y341A)后逐漸提升了血小板數(shù)目，不同劑量的rhTyrRS(Y341A)對(duì)血小板提升呈明顯的量效關(guān)系。注射rhTyrRS(Y341A)大大降低了環(huán)磷酰胺對(duì)肝臟等臟器的毒性，降低了血小板減少癥的程度及幅度，促進(jìn)了巨核細(xì)胞在血竇附近的聚集并提高了血竇周圍巨核細(xì)胞占總巨核細(xì)胞數(shù)目的比例。
　　通過(guò)一次大劑量給藥方式檢測(cè)rhTyrRS(Y341A)的急性毒性，結(jié)果顯示一次注射rhTyrRS(Y341A)(22mg/kg)，小鼠未出現(xiàn)死

7、亡，各臟器未見毒副作用。
　　本章中我們初步發(fā)現(xiàn)rhTyrRS(Y341A)可用于治療化療引起的血小板減少癥，其升血小板作用具有量效和時(shí)效關(guān)系。
　　二、rhTyrRS(Y341A)的作用機(jī)理與信號(hào)通路
　　根據(jù)第一章中rhTyrRS(Y341A)促進(jìn)了巨核細(xì)胞在血竇附近的聚集并提高了血竇周圍巨核細(xì)胞占總巨核細(xì)胞數(shù)目的比例的結(jié)果，我們采用MO7-e細(xì)胞的transwell遷移實(shí)驗(yàn)和THP-1和HUVEC細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)分

8、析rhTyrRS(Y341A)具有的促細(xì)胞遷移和黏附作用。通過(guò)RT-PCR，定量PCR和流式細(xì)胞方法證明HUVEC細(xì)胞表面的VCAM-1是細(xì)胞黏附過(guò)程中的關(guān)鍵因子。再通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)探索VCAM-1表達(dá)相關(guān)的信號(hào)通路。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rhTyrRS(Y341A)促進(jìn)了M07-e細(xì)胞的遷移和THP-1與HUVEC細(xì)胞的黏附。其遷移和黏附作用與rhTyrRS(Y341A)的量具有一定的量效關(guān)系，呈鐘形曲線分布并以10nM為頂峰。定量

9、PCR和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明rhTyrRS促進(jìn)了HUVEC細(xì)胞表面VCAM-1的表達(dá)。免疫熒光細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明rhTyrRS促進(jìn)了NFκB的入核。
　　在本章中我們發(fā)現(xiàn)rhTyrRS(Y341A)可能通過(guò)刺激NFκB信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)巨核細(xì)胞的遷移和黏附從而提升血小板。
　　三、rhTyrRS(Y341A)的中試研究
　　為了得到大量具有生物活性的rhTyrRS(Y341A)用于后續(xù)藥代動(dòng)力學(xué)和藥理毒理研究，在實(shí)驗(yàn)室搖瓶表達(dá)及5L

10、發(fā)酵罐優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用30LNBS發(fā)酵罐研究發(fā)酵工藝的最適參數(shù)。大腸桿菌經(jīng)18小時(shí)發(fā)酵后離心收集菌體。緩沖液重懸后高壓破菌并收集上清，經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換層析，凝膠過(guò)濾層析，陰離子交換層析后得到純化的rhTyrRS，經(jīng)SDS-PAGE、Western-Blot、N端測(cè)序、LC/MS、HPLC、內(nèi)毒素檢測(cè)和氨?；钚詸z測(cè)等鑒定后，以甘露醇為輔劑，制成注射用粉針劑。
　　純化后得到的5 g的rhTyrRS(Y341A)，蛋白回收率大于25