人線粒體亮氨酸t(yī)RNA結(jié)構(gòu)和功能的研究超嗜熱菌亮氨酰-tRNA合成酶雙亞基的體外重組.pdf

1、線粒體性腦肌病，乳酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥(MELAS癥)是一種罕見(jiàn)的先天性線粒體DNA病，有報(bào)道指出，位于編碼人線粒體tRNA<’Leu>(UUR)基因中的五種點(diǎn)突變與MELAS癥相關(guān)。我們構(gòu)建并轉(zhuǎn)錄獲得了這些tRNA突變體，通過(guò)體外的氨基?；瘜?shí)驗(yàn)，測(cè)定了這些點(diǎn)突變對(duì)tRNA接受莖活力的影響。結(jié)果顯示，和野生型tRNA相比，帶有這五種點(diǎn)突變的tRNA<’Leu>(UUR)轉(zhuǎn)錄子的氨基酰化水平都有不同程度的降低。進(jìn)一步的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明

2、，氨基?；阶畹偷腁3243G突變體和T3291C突變體的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。另外，T3291C突變體能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制野生型tRNA的亮氨酰化，暗示攜帶該突變的tRNA可能作為一種抑制劑存在于患者的線粒體內(nèi)。 人線粒體亮氨酸t(yī)RNA的CUN等受體(hmtRNA<’Leu>(CUN))負(fù)責(zé)解碼線粒體蛋白質(zhì)編碼系統(tǒng)中使用頻率最高的密碼子，目前有六個(gè)致病性點(diǎn)突變被定位于它的基因內(nèi)部。本文的體外實(shí)驗(yàn)顯示，和野生型的hmtRNA<’Leu>(CUN)轉(zhuǎn)

3、錄子相比，疾病相關(guān)的U48C突變體的氨基?；矫黠@升高，動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)U48C突變體更容易被氨基?；?。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)探測(cè)實(shí)驗(yàn)均顯示，野生型hmtRNA<'Leu>(CuN)具有比U48C突變體更為靈活的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)柔性使野生型tRNA的T-莖能夠在兩種潛在的配對(duì)方式之間發(fā)生滑動(dòng)。我們構(gòu)建了一系列具有特定T-莖環(huán)結(jié)構(gòu)的hmtRNA<'Leu>(CuN)突變體，用來(lái)模擬T-莖滑動(dòng)到不同階段時(shí)tRNA的分子構(gòu)象。通過(guò)研究這些突變tR

4、NA的結(jié)構(gòu)和功能，我們發(fā)現(xiàn)這種特殊的T-莖滑動(dòng)現(xiàn)象不但能夠改變tRNA的分子構(gòu)象，還可以調(diào)節(jié)hmtRNA<'Leu>(CUN)的接收莖活力，暗示這可能是一種tRNA分子調(diào)節(jié)其自身結(jié)構(gòu)和功能的新方式。分別將不同的tRNA分子固定在微球表面，以此篩選人線粒體中能夠和特定構(gòu)象的tRNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE電泳圖譜上蛋白質(zhì)的差異條帶提示我們，T-莖滑動(dòng)受阻影響了tRNA與某些配體分子的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)為我們探索相關(guān)疾病的分子機(jī)理提供了

5、新研究角度。 超嗜熱菌Aquifex aeolicus的亮氨酰-tRNA合成酶(αβ-LeuRS)是己知唯一雜合的亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)。本實(shí)驗(yàn)在α亞基基因編碼序列的5’端上游接入寡聚His標(biāo)簽的編碼序列，將帶有His-α基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中。經(jīng)過(guò)低溫下的誘導(dǎo)表達(dá)，并用Ni-NTA親和層析柱一步純化，獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的α亞基融合蛋白。將此α亞基與β亞基在體外進(jìn)行重組，獲得的重組酶具有催化tRNA<