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文檔簡介
1、食源性病毒是由食物引起導(dǎo)致人類發(fā)生疾病的病毒,由于牡蠣等貝類產(chǎn)品的濾食性特點(diǎn),對(duì)病毒有極強(qiáng)的富集作用。然而食源性病毒檢測(cè)目前多采用臨床腹瀉陽性樣本和滅活病毒疫苗,存在缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)樣品的缺陷,這給病毒的檢測(cè)和定量帶來很多問題。本文基于裝甲R(shí)NA技術(shù),利用Qbeta噬菌體分別研制諾如病毒和甲肝病毒核酸檢測(cè)用陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品,對(duì)于提高檢測(cè)的可信性與準(zhǔn)確性,保障我國食品安全,促進(jìn)我國水產(chǎn)品國際貿(mào)易、規(guī)避國際貿(mào)易壁壘均有重要現(xiàn)實(shí)意義。
1通
2、過人工合成的方式分別制備包含Qbeta噬菌體成熟酶編碼基因、衣殼蛋白編碼基因、包裝位點(diǎn)、GⅡ型諾如病毒和甲肝病毒檢測(cè)靶標(biāo)cDNA序列及輔助多克隆位點(diǎn)的QINVGⅡ和QGBHAV片段。然后通過重組酶分別將QINVGⅡ和QGBHAV片段同源克隆到pET-28a(+)載體中,經(jīng)過酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-QINVGⅡ和pET-QGBHAV。
2利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),分別將重組質(zhì)粒pET-QINVGⅡ和pET-QGB
3、HAV轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中,確定最佳表達(dá)為IPTG終濃度為0.8mM,37℃誘導(dǎo)12h。經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證在14.4kDa左右有目的條帶;經(jīng)透射電鏡觀察病毒樣顆粒直徑為27nm,與預(yù)期結(jié)果一致。證實(shí)衣殼蛋白表達(dá)成功并能組裝成噬菌體病毒樣顆粒。
3通過超聲破碎細(xì)菌,經(jīng)DNaseⅠ和Rnase A消化后利用CsC1密度梯度離心和純化。制備的兩種假病毒粒子無重組質(zhì)粒殘留,可以用于熒光定量檢測(cè)。
4利用熒光定量PC
4、R技術(shù)成功證實(shí)兩種病毒樣顆粒中包裝的核酸分別是諾如病毒RNA和甲肝病毒RNA。將病毒RNA梯度稀釋后,經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證線性關(guān)系良好,方法檢出限為10拷貝/反應(yīng),有很好的重復(fù)性,可以用于病毒檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)樣品。定值結(jié)果顯示制備的含GⅡ型諾如病毒的病毒樣顆粒含量為2×109拷貝/μL,瓶間變異系數(shù)為3.48%;含甲肝病毒的病毒樣顆粒含量為3×109拷貝/μL,瓶間變異系數(shù)為4.26%。
5將制備好的兩種病毒樣顆粒分別稀釋至2×10
5、7拷貝/μL和106拷貝/μL,放置于不同條件下進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明:非凍干狀態(tài)的樣本在37℃能保存半個(gè)月,室溫可穩(wěn)定保存25天,2-8℃可穩(wěn)定放置5個(gè)月,-20℃穩(wěn)定放置至少5個(gè)月;凍干狀態(tài)的樣本在37℃和25℃下不穩(wěn)定,在4℃和-20℃能穩(wěn)定放置5個(gè)月。
本研究得到了分別含有GⅡ型諾如病毒和甲肝病毒檢測(cè)核酸序列的兩種病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)樣品,可以作為目前臨床腹瀉陽性樣本和滅活病毒疫苗制備的質(zhì)控品的替代品,適用于疾控、質(zhì)檢
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