基于同步輻射軟X射線誘變的產(chǎn)L-乳酸米根霉育種研究.pdf

1、L－乳酸是廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)的重要有機酸，以其為原料制備的聚L－乳酸是一種生物相容性優(yōu)良的新型可生物降解材料。米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸具有營養(yǎng)要求簡單、產(chǎn)L－乳酸光學(xué)純度高等優(yōu)點。但目前用于發(fā)酵產(chǎn)L－乳酸的米根霉菌種普遍存在發(fā)酵強度低、發(fā)酵性能差等問題。輻射誘變是微生物菌種獲得穩(wěn)定、優(yōu)良性狀的重要方法，而同步輻射軟X射線覆蓋了生命分子重要組成元素的碳、氮、氧的k吸收邊波長，具有很好的生物學(xué)效應(yīng)，是一種具有開發(fā)應(yīng)用前景的微生物輻射誘

2、變源。
　　本文基于同步輻射軟X射線誘變，依據(jù)米根霉產(chǎn)L－乳酸的代謝控制原理，以提高L－乳酸產(chǎn)量、增大發(fā)酵強度、改善發(fā)酵條件適應(yīng)性為目標(biāo)，針對米根霉的誘變方法與定向選育技術(shù)開展研究，采用代謝分析、基因突變檢測、蛋白質(zhì)組表達量差異分析等技術(shù)對其突變的機理進行探討，主要研究結(jié)論如下：
　　(1)在中國科技大學(xué)國家同步輻射實驗室的軟X射線輻照裝置上，通過考察孢子吸附固定載體的材料、樣品架載樣量等因素，確定了適合米根霉同步輻射軟X射

3、線輻照的條件。研究獲得米根霉孢子在Ck(4.4 nm)、Nk(3.02 nm)、Ok(2.3 nm)波長軟X射線輻照條件下的致死劑量曲線，并通過致死效應(yīng)、能量沉積效應(yīng)分析，選擇Nk波長軟X射線為米根霉主要的輻射誘變源。以乙醇脫氫酶(ADH)活力弱化突變率為指標(biāo)，通過分析致死率與正突變率的關(guān)系，確定了同步輻射軟X射線Nk輻射誘變米根霉突變最適劑量范圍為0.4kGy-0.8kGy。
　　(2)以AS3.819為出發(fā)株，經(jīng)同步輻射軟X射

4、線誘變選育獲得ADH弱化突變株ADH-21。突變株的L－乳酸產(chǎn)量為94.01g/L，比出發(fā)株的L－乳酸產(chǎn)量82.49 g/L提高了13.97%，而乙醇生產(chǎn)量較出發(fā)株降低了70.99%。突變株的乳酸脫氫酶(LDH)活力較出發(fā)株提高了34.7%，而ADH活性比出發(fā)株的降低了79.85%。可見下調(diào)ADH活性是減少米根霉副產(chǎn)物乙醇生成量，增加L－乳酸產(chǎn)量的有效方法。經(jīng)分離、純化得到出發(fā)株與突變株的ADH，發(fā)現(xiàn)pH值及[Zn2+]、[Mg2+]對

5、二者的ADH活性影響規(guī)律基本相同，但突變株的ADH最適反應(yīng)溫度更低，會導(dǎo)致突變株ADH活力下降。另外，通過對出發(fā)株與突變株ADH基因的cDNA測序、分析，獲得比對結(jié)果。
　　(3)利用弱化氧化磷酸化過程降低胞內(nèi)能荷水平對糖酵解影響的調(diào)控機理，以AS3.819為出發(fā)株，經(jīng)同步輻射軟X射線誘變選育獲得F0F1-ATPase活力明顯降低、胞內(nèi)能荷下降了29.5%的突變株F0F1-17。突變株的糖酵解途徑關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮

6、酸激酶(PK)、磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)的活性分別比出發(fā)株增加了58.5%，24.8%和19.8%。突變株的葡萄糖消耗速率、平均比消耗速率(qs)、L-乳酸發(fā)酵強度及平均比生成速率(qp)較出發(fā)株分別提高17.5%，85.9%，24.1%及61.5%。突變株的最高產(chǎn)量達到91.54g/L，發(fā)酵周期較出發(fā)株縮短了約6h。說明胞內(nèi)的能荷狀態(tài)降低，糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性增強，導(dǎo)致米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵性能提高。
　　(4)利用M

7、g2+激活己糖激酶(HK)，研究[Mg2+]上調(diào)對F0F1-17及AS3.819的發(fā)酵性能影響。表明在Mg2+調(diào)節(jié)作用下，HK活性的微幅增加可導(dǎo)致米根霉菌株產(chǎn)L-乳酸發(fā)酵過程的發(fā)酵性能微幅增強，這種增強的幅度在F0F1-ATP合酶(F0F1-ATPase)活力弱化突變株中表現(xiàn)更明顯。由此，以米根霉F0F1-17為出發(fā)株，經(jīng)同步輻射軟X射線誘變選育獲得HK活力增加85.3%突變株HK-3。與出發(fā)株及AS3.819相比，HK-3的葡萄糖消耗

8、速率、葡萄糖的平均比消耗速率分別增加了29.8%、141.4%及27.9%、50.3%。HK-3發(fā)酵L-乳酸產(chǎn)量達到97.53g/L，其發(fā)酵強度及產(chǎn)物平均比生成速率qp分別比出發(fā)株F0F1-17增加41%和71.8%、比AS3.819分別增加75%和177.5%。說明降低F0F1-ATPase活性、提高HK活性，米根霉菌株能獲得較好的發(fā)酵性能。
　　(5)為提高米根霉在酸性環(huán)境中的發(fā)酵性能，以AS3.819為出發(fā)株，經(jīng)同步輻射軟X

9、射線誘變選育獲得耐酸突變株acid-18。中和劑碳酸鈣添加量為30g/L時，突變株的L-乳酸產(chǎn)量為83.5g/L，比出發(fā)株提高26.53%，其LDH比出發(fā)株提高42.2%。另外，突變株的質(zhì)膜H+-ATPase酶活高于出發(fā)株的原因可能與突變株耐酸性增強相關(guān)。通過二維雙向電泳分離、PDQuest軟件分析，發(fā)現(xiàn)耐酸突變株與出發(fā)株蛋白質(zhì)組表達量差異點有475個，其中豐度差異顯著的12個點，并確定這12個蛋白的分子量和等電點。經(jīng)質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫檢