新型抗生素UDP-3-O-(R-羥基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脫乙酰酶(LpxC)抑制劑的設(shè)計、合成及活性研究.pdf

1、研究背景：
　　革蘭氏陰性菌耐藥及耐藥菌感染問題已成為公眾健康的最大威脅之一，是21世紀(jì)抗感染領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。因此，尋找具有全新抗菌機(jī)制和抗菌靶點的新型抗菌藥物已迫在眉睫。
　　在革蘭氏陰性菌中，UDP-3-O-(R-羥基十四酰)-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?LpxC)，是一種鋅離子依賴性蛋白水解酶，它催化脂質(zhì)A生物合成中最關(guān)鍵一步，為革蘭陰性菌生存和毒力所必需。此外，LpxC酶在革蘭氏陰性菌不同菌株中高度保守，與其它

2、已知鋅蛋白酶相比不具有同源性。因此，LpxC作為抗菌新靶點已成為近年來抗菌藥物研究中的熱點領(lǐng)域，針對這一靶標(biāo)設(shè)計合成抑制劑是當(dāng)前抗菌藥物研究中很有發(fā)展前景的一類。
　　目標(biāo)化合物的設(shè)計、合成及活性篩選
　　對已有LpxC抑制劑的藥效團(tuán)和定量構(gòu)效關(guān)系總結(jié)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有高活性的LpxC抑制劑都具有共同的結(jié)構(gòu)特征即含有與催化活性中心Zn2+螯合的基團(tuán)（如異羥肟酸等）和與酶的疏水通道之間有效結(jié)合的疏水側(cè)鏈。除上述兩個主要的抑制劑結(jié)合

3、位點外，還有“UDPbindingsite”這一結(jié)合位點，它對于促進(jìn)底物與酶的識別和結(jié)合非常重要，是當(dāng)前LpxC抑制劑設(shè)計的重要方向之一。在充分調(diào)研文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本研究以LpxC為靶標(biāo)，基于LpxC與其抑制劑作用模式，借助計算機(jī)輔助藥物設(shè)計，結(jié)合構(gòu)象限制、電子等排等策略，設(shè)計了系列新型的LpxC抑制劑。在合成目標(biāo)化合物之前，我們利用SYBYL8.0對所設(shè)計的化合物進(jìn)行了對接打分，結(jié)果顯示大部分化合物分值都接近于甚至超過陽性對照。這說明了

4、我們設(shè)計思路的合理性，為我們的研究提供了理論依據(jù)。
　　合成過程中，A系列以L-羥脯氨酸為起始原料，經(jīng)過系列反應(yīng)如酯化、Boc保護(hù)或磺化、SN2親核取代、Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)、縮合反應(yīng)、Sonogashira Coupling、Mitsunobu Reaction等合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。B系列以各種L構(gòu)型氨基酸為起始原料，經(jīng)過系列反應(yīng)如Sonogashira Coupling、酯水解、縮合反應(yīng)、Glaser Co

5、upling等合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。C系列分別以兩種光學(xué)結(jié)構(gòu)的氯霉胺及D-對甲砜基苯絲氨酸乙酯為起始原料，經(jīng)過系列反應(yīng)如Boc保護(hù)，羥基的選擇性氧化、Sonogashira Coupling、酯水解、縮合反應(yīng)、Glaser Coupling等合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。D系列由B系列的中間體（S)-2-（4-乙炔基苯甲酰胺基）-4-甲硫基-丁酸甲酯經(jīng)硫醚氧化成砜或亞砜與Boc保護(hù)的乙炔苯胺進(jìn)行Glaser

6、Coupling合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。最后這些羧酸甲酯前體化合物均通過酯交換轉(zhuǎn)化成異羥肟酸而得到目標(biāo)化合物。
　　對所合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行了初步的生物活性評價，包括最低抑菌濃度MIC的測定，抑菌環(huán)試驗及體外抑酶活性實驗三方面，以期更準(zhǔn)確地篩選出高活性的LpxC抑制劑。
　　結(jié)果：
　　所有目標(biāo)化合物均由1HNMR、HR-MS等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)Scifinder等文獻(xiàn)檢索工具證實，所合成的目標(biāo)化合物

7、均為新型化合物，未見文獻(xiàn)報道。四系列化合物都表現(xiàn)出對革蘭氏陰性菌(E.coilATCC25922和P.aeruginosaATCC27853)的選擇性抑菌作用，對兩株革蘭氏陽性菌（S.A.ATCC25923和MRS.A.ATCC29213）則無明顯抑菌作用。通過上述兩株革蘭氏陰性菌株的初篩，對活性較好的化合物進(jìn)行了三株耐藥菌株（E.coilMDR、P.aeruginosaMDR和E.cloacaeMDR）的MIC測定。部分目標(biāo)化合物的抑

8、菌活性與陽性對照LPC009相比略弱。對活性最好的化合物D1和D2還進(jìn)行了大腸桿菌野生型菌株(E.coilW3110)和membrane-compromisedstrain(E.coilCMR300)的MIC的測定，此部分工作由DukeUniversity完成。
　　此外，對活性最好的兩個化合物D1和D2，進(jìn)行了兩株細(xì)菌(E.coilATCC25922和P.aeruginosaATCC27853）的抑菌環(huán)試驗。結(jié)果顯示測試化合物與

9、陽性對照藥LPC009、Levofloxacin、Claforan抑菌活性相當(dāng)。
　　LpxC抑制劑的酶活測定方法條件比較苛刻，故根據(jù)上述MIC的測定結(jié)果，選取抗菌活性最好的兩個化合物D1和D2進(jìn)行EcLpxC的酶活測定，此部分工作由DukeUniversity完成，活性結(jié)果表明所測兩個化合物與陽性對照LPC028的抑酶活性相當(dāng)，可作為抗革蘭陰性菌先導(dǎo)進(jìn)行深入研究。
　　結(jié)論：
　　本研究基于LpxC的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑