N-乙酰鳥氨酸脫?；富虻目寺∨c原核表達.pdf

1、N-乙酰鳥氨酸脫?；?N-acetylornithine deacetylase，簡稱NAOase；EC3.5.1.16)，具有廣泛的底物特異性，可選擇性地作用于L-型?；被?，可應(yīng)用于脂肪族氨基酸拆分，在氨基酸生產(chǎn)中具有重要的地位。除此之外，NAOase還可作為靶標用于研究新型抗生素。本文主要研究了N-乙酰鳥氨酸脫?；富虻目寺∨c原核表達。
　　 本文首先通過設(shè)計E.coli K12中的N-乙酰鳥氨酸脫?；富?ar

2、gE兩端的引物，成功獲取了E.coli K12的argE全基因。經(jīng)基因序列比對表明，所獲基因與GeneBank中的argE基因(X55417)同源性達到100％，argE基因全長1152 bp，編碼383個氨基酸。
　　 本文以pET22b為表達載體，在正向引物設(shè)計過程中，將目的基因的第四個堿基A突變成G，并與攜帶和不攜帶6*His標簽的兩種反向引物組合，構(gòu)建了兩種不同的表達載體pET22b(+)-argE。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌

3、BL21(DE3)，構(gòu)建了可大量表達N-乙酰鳥氨酸脫?；傅闹亟M菌。經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明兩種重組菌皆可有效表達argE基因。
　　 結(jié)合兩種重組菌的生物量、表達量和酶活實驗結(jié)果，可以推斷構(gòu)建組合1中在重組NAOase的C末端引入的His標簽對酶的活性無明顯影響?？紤]到后期純化，選擇以重組菌BL21(DE3)/pET22b-argE1為實驗菌種。分別對重組菌BL21(DE3)/pET22b-argE的菌體、菌體的培養(yǎng)外液

4、、細胞質(zhì)可溶部分及不溶組分經(jīng)適當處理后進行10.0％SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表達產(chǎn)物N-乙酰鳥氨酸脫酰基酶大多數(shù)以不可溶的包涵體形式表達，少量以有活性的可溶形式表達。
　　 在LB液體培養(yǎng)基中，有效提高N-乙酰鳥氨酸脫?；富钚员磉_的最佳誘導(dǎo)條件為：采用乳糖為誘導(dǎo)劑，乳糖濃度15.0 g/L，誘導(dǎo)溫度為20℃，誘導(dǎo)起始OD值為0.46，誘導(dǎo)時間18 h。Mg+對酶活及生物量影響不大。在誘導(dǎo)劑乳糖加入2.5 h后加濃度為5.

5、0 mg/L的Zn2+可提高酶活到360 U/mL，為Zn2+添加前的1.3倍，為誘導(dǎo)條件優(yōu)化前30℃誘導(dǎo)時的6倍，優(yōu)化效果顯著。
　　 將重組菌BL21(DE3)/pET22b-argE分別在LB(+)和LB(-)上連續(xù)培養(yǎng)50代，重組質(zhì)粒pET22b(+)-argE在含有羧芐青霉素選擇壓力下，質(zhì)粒全部存在(100％)；而該質(zhì)粒在不含任何選擇性壓力下，30代前質(zhì)粒能維持在宿主菌中，50代后質(zhì)粒幾乎全部丟失(僅存2％)。采用羧芐