基于點印跡的水產品過敏原檢驗方法的研究.pdf

1、食品過敏已引起了全球多個國際組織和國家的高度重視，但食物過敏原的診斷仍然是個挑戰(zhàn)。由于體內實驗的安全性問題，體外實驗檢驗食物過敏原正受到越來越多的關注。目前已有很多體外過敏原特異性IgE檢測設備及試劑盒被廣泛應用，以Immuno CAP為代表的檢測儀器準確率高但設備費用昂貴，普及率低。此外，食物過敏原由于地域性差異其種類也有很大的區(qū)別，現有的檢驗試劑盒多為進口，過敏原組合不符合中國國情、結果準確性及重現性較差。本研究立足上述問題，旨在研

2、究出一種結果準確、適用于我國過敏人群、操作簡便快捷、成本較低的食物過敏原檢驗方法。
　　 本論文以我國過敏人群主要食物過敏原魚類為研究對象，通過過敏原鑒定、交叉反應研究及加工對過敏原免疫活性的影響的研究探討用以檢驗的過敏原的選擇條件；建立了基于點印跡檢驗方法的肉眼可視化食物過敏原檢驗方法并進行了性能測定，最后通過與其他檢驗方法的結果比對驗證其準確性。主要內容如下：
　　 1、對青島地區(qū)常見的7個魚類品種進行了過敏原鑒定，

3、發(fā)現真鯛、阿拉斯加狹鱈、鯉魚、鮭魚、藍點馬鮫、大菱鲆及大黃花魚等的過敏原蛋白分子量為35～42kD、48～51kD、28～30kD及17kD，其中主要過敏原為41kD蛋白，并非國際公認的小清蛋白；7種魚過敏原蛋白之間存在著嚴重的交叉反應，故可選擇其中一種作為魚肉過敏原代表進行檢驗，檢驗結果基本可表示魚類過敏原總體情況。
　　 2、研究發(fā)現經過熱加工后，大菱鲆魚肉蛋白組分中分子量較大的蛋白有很大程度的降解，免疫活性基本喪失；熱加工

4、使魚肉過敏原蛋白的免疫活性降低，蒸5min后免疫活性降低67.9％，蒸30min后減少了89.2％的免疫活性：而魚肉中小清蛋白及其免疫活性并未隨著加熱發(fā)生明顯改變，耐熱性好。而加熱后，魚肉蛋白中產生了一條新的具有致敏性的蛋白，分子量～18kD。實驗結果表明，熱加工對的魚肉過敏原的免疫活性有較大的改變，對生鮮魚肉產生過敏反應不一定會對加工后的魚肉產生相同反應，反之亦然。這對過敏原的檢驗方法的研究具有一定的指導意義，即：過敏原的檢驗中有必要

5、將生鮮食物與經過不同加工方式的食物過敏原進行細分，從而得到更加準確的檢驗結果，也可為過敏患者提供一定的食用指導。
　　 3、采用硝酸纖維素膜作為水產品過敏原載體，建立了肉眼可視化點印跡檢驗水產品過敏原的方法，即：過敏原蛋白點樣濃度為1mg/mL，人血清用50％封閉液稀釋10倍，于37℃孵育1h，二抗采用1:1000倍稀釋的HRP-羊抗人IgE，于37℃孵育45min，顯色液采用沉淀型TMB顯色液避光顯色15min，且過敏反應程度

6、與點灰度值正相關。檢驗方法性能測定結果表明，硝酸纖維素膜內變異系數為1.9％～6.7％，膜間變異系數在3.3％～8.9％之間，穩(wěn)定性良好。
　　 4、通過與皮膚點刺試驗、免疫印跡實驗結果的比對表明，三種方法結果無顯著性差異。其中，肉眼可視化點印跡檢驗的結果與免疫印跡結果一致性為82％、與皮膚點刺試驗結果一致性為62％。此外，肉眼可視化點印跡檢驗方法與一種商業(yè)化的食物過敏原檢驗試劑盒相比，檢驗結果與免疫印跡和皮膚點刺試驗結果更加接