擬穴青蟹過敏原的性質(zhì)研究.pdf

1、近年來食物過敏問題越來越受到人們的關(guān)注，每年由于過敏食物引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)的人不在少數(shù)，甚至危及生命。國內(nèi)外的研究表明，由蟹類食物引起的過敏發(fā)病率逐漸上升，蟹類中含有兩種重要過敏原：原肌球蛋白(tropomyosin，TM)和精氨酸激酶(arginine kinase，AK)。目前對于TM的研究較多，但大多集中在提取純化及免疫學(xué)方面的研究；對于AK而言，則更多集中在酶學(xué)性質(zhì)及分子克隆方面的研究。因此，加強(qiáng)對AK和TM的過敏原性質(zhì)研究顯得十

2、分重要。
　　 本研究以擬穴青蟹為原料，首先對其AK和TM分別進(jìn)行提取純化，建立AK和TM的ELISA檢測技術(shù)，并應(yīng)用于水產(chǎn)品中AK和TM含量的檢測。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、免疫印跡(western blotting) 及酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等方法研究AK的理化性質(zhì)及消化穩(wěn)定性。其次，采用不同加工處理方法對蟹肉進(jìn)行處理，分析加工處理對蟹肉TM的消化穩(wěn)定性及致敏性的影響。最后采用體外模

3、擬胃腸液二相消化實(shí)驗(yàn)比較AK和TM的消化穩(wěn)定性，并對AK和TM的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。
　　 采用硫酸銨鹽析、柱層析等方法對AK進(jìn)行提取純化，首先對AK的溫度、pH穩(wěn)定性及消化穩(wěn)定性作了相關(guān)研究，結(jié)果顯示，AK為熱不穩(wěn)定蛋白，在溫度達(dá)到46℃后，隨著溫度的升高，AK逐漸形成多聚體，進(jìn)而凝聚形成沉淀，即發(fā)生了蛋白質(zhì)變性作用。在強(qiáng)酸性緩沖液(pH 1.0）中孵育1.5 h后可以發(fā)現(xiàn)AK產(chǎn)生了部分降解。參照美國藥典中模擬胃、腸液消化實(shí)驗(yàn)方

4、法，AK經(jīng)胃蛋白酶消化1 h后原始條帶被完全降解，但AK并不容易被腸液中的胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶降解，且肌漿蛋白中其他蛋白的存在會(huì)影響AK的模擬胃、腸液消化特性。其次，以純化所得AK建立了ELISA檢測技術(shù)，并對八種不同水產(chǎn)品中AK含量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，甲殼類動(dòng)物如南美白對蝦、斑節(jié)對蝦和蝦蛄中AK的相對含量較高，而軟體動(dòng)物及雙殼綱動(dòng)物中AK含量則較低。
　　 采用等電點(diǎn)沉淀、硫酸銨鹽析等方法對TM進(jìn)行提取純化，并通過不同加工

5、方法(蒸煮、超聲波結(jié)合蒸煮、高溫高壓、蟹肉罐頭處理、烹飪處理等)處理蟹肉，參照美國藥典中模擬胃、腸液消化實(shí)驗(yàn)方法，對處理后蟹肉的TM粗蛋白進(jìn)行消化，分析其消化穩(wěn)定性及消化產(chǎn)物的致敏性。結(jié)果顯示，不同加工處理方法對蟹肉中TM的消化穩(wěn)定性均有一定影響，其中高溫高壓處理能在較大程度上促進(jìn)TM在模擬胃、腸液消化過程中的降解，TM及其消化產(chǎn)物的致敏性也有所降低。在蟹肉罐頭加工處理過程中，植酸鈉的添加能在一定程度上促進(jìn)TM的降解，使其更容易被胃液及

6、腸液分解。另外，在蟹類食品烹飪過程中添加適量的醋也能促進(jìn)TM在模擬胃液中的消化分解。總結(jié)幾種加工方法，高溫高壓處理在降低TM過敏性方面最為顯著。同樣以純化所得TM建立了ELISA檢測技術(shù)，對水產(chǎn)品中TM含量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，甲殼類動(dòng)物如南美白對蝦、斑節(jié)對蝦和蝦蛄中TM的相對含量較高，而軟體動(dòng)物及雙殼綱動(dòng)物中TM含量則較低。
　　 最后，對蟹肉粗提液進(jìn)行了體外模擬胃腸液二相消化實(shí)驗(yàn)，并對AK和TM的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果

7、顯示，在體外模擬胃腸液二相消化實(shí)驗(yàn)中，AK比TM容易被胃蛋白酶降解，而TM則對胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的消化作用不耐受。此外，TM的三級結(jié)構(gòu)比AK簡單，主要為超螺旋結(jié)構(gòu)，而AK則有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，含有α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，AK和TM三級結(jié)構(gòu)的不同可能導(dǎo)致二者理化性質(zhì)及消化穩(wěn)定性方面的差異。
　　 總的來說，本研究分析了蟹類AK的理化性質(zhì)及消化穩(wěn)定性，首次證實(shí)AK為對熱、酸均不穩(wěn)定的過敏原。重點(diǎn)對蟹類TM的加工特性進(jìn)行了探索