肌肉細(xì)胞來源exosome的分析鑒定及在杜興肌肉萎縮癥小鼠模型上的初步研究.pdf

1、分類號(hào)：R5962密級：內(nèi)部2年學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位團(tuán)專業(yè)學(xué)位口◇學(xué)校代碼：10062學(xué)號(hào)：2010602027學(xué)科門類：理學(xué)又肄簣科鼻辱T輔潮尉N麓纛臻l蠡霸氐翎l鑲黯耋釋碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATIoN論文題目：肌肉細(xì)胞來源exosome的分析鑒定及在杜興肌肉萎縮癥小鼠模型上的初步研究TITLECharacterizationOfmyoblast—derivedexosomesandevaluationinDuch

2、enneMuscularDystrophymousemodels一級學(xué)科：生物學(xué)二級學(xué)科：生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文作者：牛鴻婧指導(dǎo)教師：尹海芳教授導(dǎo)師組成員：天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二。一三年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士論文中文摘要目的：Exosome是一種大小在40100nna之間的囊泡狀膜結(jié)構(gòu)，不同細(xì)胞來源的exosome含有不同的蛋白和RNA成分。Exosome在抗原呈遞、細(xì)胞間信息傳遞和運(yùn)輸?shù)冗^程中起著重要的作用。由于exosome能夠獲取

3、源細(xì)胞中的多種蛋白或RNA(mRNA和microRNA)，并進(jìn)行細(xì)胞間傳遞，是細(xì)胞內(nèi)信使及內(nèi)源性蛋白和RNA的運(yùn)輸載體。因此我們在前期工作中，利用小鼠未成熟樹突狀細(xì)胞來源的exosome作為運(yùn)輸載體，來嘗試運(yùn)輸外源siRNA藥物。通過對exosome特異性靶向修飾，賦予其靶向腦神經(jīng)的能力，從而成功地將siRNA運(yùn)輸?shù)侥X神經(jīng)中，介導(dǎo)特異性靶基因下調(diào)，證明exosome可以作為外源基因的運(yùn)輸載體。因此在本論文中，我們嘗試?yán)胑xosome運(yùn)

4、輸反義寡核苷酸藥物，并以杜興肌肉萎縮癥(DMD)作為疾病測試模型評估exosome作為反義寡核營酸藥物載體的能力和潛力。DMD是由dystrophin基因突變導(dǎo)致的dystrophin蛋白缺失所引發(fā)的一種致死性神經(jīng)肌肉失調(diào)癥，到目前為止，臨床上未有任何有效的治療方法。反義寡核苷酸介導(dǎo)的外顯子跳讀的治療方法是最有應(yīng)用前景的治療方法之一，已處于臨床III期試驗(yàn)，結(jié)果喜人。然而臨床上測試的反義寡核苷酸藥物存在系統(tǒng)運(yùn)輸效率低的問題，本研究擬以e

5、xosome作為反義寡核苷酸藥物的運(yùn)輸載體，以期提高反義寡核苷酸藥物在肌肉中的系統(tǒng)運(yùn)輸效率。方法：1Exosome的制備：利用多步超速離心法。首先通過1000g，15mins離心去除細(xì)胞碎片；取上清，利用12，000g，20mins離心后，再用022岬濾膜過濾，去除雜質(zhì)；收集上清，通過100，000g，超速離心70mins，用PBS重懸沉淀，獲得exosome。2Exosome的生化鑒定：利用exosome的標(biāo)志性蛋白Alix和TSGl

6、01，通過WesternBlot來檢測exosome的存在；為確定無細(xì)胞碎片的污染，使用細(xì)胞器線粒體中的蛋白CytochromeC作為檢測指標(biāo)。3Exsome的形態(tài)鑒定：利用透射電子顯微鏡觀察exosome形態(tài)特征。將醋酸銨重懸的exosome滴加到附有碳膜的銅網(wǎng)上5mins，棄去剩余液體后自然干燥。滴加1％磷鎢酸染液2mins，棄去染液，干燥后用透射電鏡觀察。4Exosome的密度確認(rèn)：利用蔗糖梯度離心的方法，檢測exosome的密度