豬胃腸道蛭弧菌的多樣性及其分離鑒定和捕食作用的初步研究.pdf

1、畜禽生產(chǎn)中，抗生素不僅用于預(yù)防和治療疾病，而且更廣泛地用作促生長(zhǎng)飼料添加劑，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、提高飼料利用率和降低動(dòng)物的死亡率?？股?zé)o限制地持續(xù)使用，會(huì)引起日趨嚴(yán)重的細(xì)菌多重耐藥性問題和動(dòng)物性食品抗生素殘留問題。長(zhǎng)此以往，不僅會(huì)影響?zhàn)B殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，也會(huì)成為危害人類健康和公共安全的重大隱患。蛭弧菌作為一種革蘭氏陰性捕食細(xì)菌，具有寄生和裂解革蘭氏陰性細(xì)菌的生理特性。大量研究表明，蛭弧菌具有替代抗生素抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的潛在作用。但是，

2、迄今為止蛭弧菌的研究都是基于水和土壤環(huán)境中的分離菌株而展開的，動(dòng)物腸道內(nèi)蛭弧菌的多樣性及性能的研究卻少有涉及。因此，本論文擬圍繞豬腸道內(nèi)蛭弧菌的多樣性以及其分離菌株捕食性能展開深入系統(tǒng)的研究，試驗(yàn)分為兩個(gè)部分:
　　一、豬胃腸道蛭弧菌的分布及其在胃中的多樣性研究
　　本試驗(yàn)旨在探究豬胃腸道內(nèi)蛭弧菌的分布及其在胃中的多樣性，在填補(bǔ)動(dòng)物胃腸道內(nèi)蛭弧菌研究空白的同時(shí)，也為分離豬腸源噬菌蛭弧菌提供理論依據(jù)。試驗(yàn)中，采集豬胃、十二指腸

3、、回腸、盲腸和結(jié)腸等部分食糜;提取總菌DNA進(jìn)行蛭弧菌16S rDNA部分序列特異性擴(kuò)增;通過qPCR檢測(cè)各腸段蛭弧菌的數(shù)量;構(gòu)建豬胃部蛭弧菌16S rDNA序列的克隆庫探究其多樣性。結(jié)果表明，豬胃腸道各部分均出現(xiàn)蛭弧菌16S rDNA部分序列的特異性擴(kuò)增;后腸段（盲腸、結(jié)腸）蛭弧菌數(shù)量普遍高于胃和前腸段（十二指腸、回腸），其中盲腸數(shù)量最多，為104.32 copies/g，十二指腸數(shù)量最少，為102.77 copies/g，兩者之間差

4、異顯著(P＜0.05);構(gòu)建克隆庫后經(jīng)酶切分型共得到5種不同的蛭弧菌16S rDNA序列，將其命名為ST1～ST5。由系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出，序列ST1、ST5和ST2、ST3分別屬于Bacteriovorax屬和Bdellovibrio屬的新菌種，序列ST4與Bdellovibrio starrii在同一進(jìn)化分支。
　　二、豬腸源噬菌蛭弧菌的分離鑒定及其對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的捕食作用的初步研究
　　本試驗(yàn)旨在從豬胃腸道內(nèi)分離、純化

5、噬菌效果良好的噬菌蛭弧菌菌株，檢測(cè)其對(duì)兩種革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌）的捕食作用，為緩解國(guó)內(nèi)畜禽養(yǎng)殖業(yè)中革蘭氏陰性細(xì)菌多重耐藥性的日益嚴(yán)重提供新的途徑。試驗(yàn)中，采用雙層瓊脂平板法，以施氏假單胞菌為宿主菌，在37℃條件下，對(duì)豬胃、十二指腸、回腸、盲腸和結(jié)腸等部分食糜進(jìn)行噬菌蛭弧菌的分離。結(jié)果表明，該5部分食糜均可分離出裂解宿主菌產(chǎn)生噬菌斑的菌株，選擇噬菌效果最好的胃部菌株進(jìn)行純化和鑒定。通過對(duì)分離菌株進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察和16S

6、 rDNA序列比對(duì)，進(jìn)一步確認(rèn)其為噬菌蛭弧菌，且與經(jīng)典菌株Bdellovibrio bacteriovorus HD100處于進(jìn)化樹同一進(jìn)化分支。然后，繼續(xù)采用雙層瓊脂平板法，以多重耐藥性大腸桿菌和沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株為宿主菌，宿主菌濃度均為106 cfu/mL，在37℃條件下檢測(cè)分離菌株的捕食性能。結(jié)果表明，兩種宿主菌平板上均能出現(xiàn)噬菌斑，說明該分離菌株對(duì)于這兩株革蘭氏陰性致病菌都具有裂解能力;大腸桿菌平板和沙門氏菌平板的噬菌斑數(shù)量分別為1