小鼠胚胎胃腸道細(xì)菌分離與鑒定.pdf

1、微生物由于個(gè)體小，數(shù)量大，繁殖快和適應(yīng)性強(qiáng)而廣泛分布于自然界。在動(dòng)物機(jī)體與外界相接觸或相通的部位，皆有微生物的存在。國內(nèi)外微生態(tài)學(xué)界普遍認(rèn)為：消化道正常菌群的建立是在動(dòng)物出生之后，而健康母體的子宮和胚胎的消化道是無菌的。但在動(dòng)物養(yǎng)殖實(shí)踐中，可見到新生仔豬隨著胎糞的排出立即出現(xiàn)腹瀉或下痢。這啟示我們：是否在胚胎發(fā)育階段消化道就已經(jīng)存在某些正常菌群，由于出生后氣體的溫度、濕度等環(huán)境條件的急劇改變，正常菌群失衡而導(dǎo)致腹瀉或下痢。 本研

2、究對(duì)常規(guī)飼養(yǎng)、正常妊娠的不同胚齡昆明系小白鼠的胚胎后期胃腸道細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定。選擇多種不同類型的培養(yǎng)基對(duì)小鼠胚胎腸道的內(nèi)容物進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，通過對(duì)分離的具有代表性菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征和糖發(fā)酵試驗(yàn)等一系列生理生化試驗(yàn)，比對(duì)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步判定所分離到細(xì)菌的種屬和特點(diǎn)。并利用分析細(xì)菌的16SrRNA的方法來鑒定分離的代表性菌株。在傳統(tǒng)表型鑒定的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)細(xì)菌的通用引物，以分離出的細(xì)菌菌株所提

3、取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增出目的基因片段，純化回收產(chǎn)物并連接到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109菌株，在含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板上篩選陽性重組子。提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、PCR分析，將檢測(cè)陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果分別與Genbank上發(fā)表的同屬的代表菌株的16SrDNA序列比較，得到相似性百分比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，則可判定菌株的歸屬。 從小鼠胚胎后期消化道中分離到36株細(xì)菌，選取其中具有代表性的10株菌進(jìn)

4、行傳統(tǒng)鑒定和16SrRNA序列分析，依據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)和描述，以及從所獲得的陽性克隆中選擇出代表性克隆進(jìn)行測(cè)序，并將序列提交美國國家生物信息中心(NCBI)進(jìn)行同源性比對(duì)。分析顯示，序列中有6條與4個(gè)己知的細(xì)菌屬具有同源性，分別是微球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、變形桿菌屬(Proteus)和雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)，表明小鼠胚胎后期消化道中存在有與出生后腸道

5、中相似的正常微生物菌群，并且G+占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，細(xì)菌的平均數(shù)量達(dá)到1.2×102～3.2×102CFU/g。這將為深入研究動(dòng)物體從胚胎發(fā)育開始即與動(dòng)物體終生共存的正常菌群的來源、分布、生態(tài)、生理特性及其生物學(xué)意義提供細(xì)菌學(xué)依據(jù)，將豐富微生物在自然界分布的科學(xué)理論。 正常微生物群在動(dòng)物內(nèi)環(huán)境中的定居、繁殖是與宿主之間長期歷史進(jìn)化的必然結(jié)果，通過適應(yīng)機(jī)制和自然選擇形成長期共存、相互影響的動(dòng)態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，是動(dòng)物體生命活動(dòng)中不可缺